L'obiettivo del presente protocollo è quello di testare la capacità di cellule progenitrici derivate dal tessuto adiposo umano perivascolare di differenziarsi in stirpi multipli delle cellule. La differenziazione è stata confrontata alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano, che è noto per differenziare in adipociti, Osteocita e lignaggi di condrociti.
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Articolo metodologico
Capacità di differenziazione delle cellule progenitrici umane aortica perivascolare adiposo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tessuto adiposo è una ricca fonte di multi-potente cellule staminali mesenchimali (MSC) in grado di differenziarsi in osteogenica, adipogenico e condrogenica lignaggi. Adipogenico differenziazione delle cellule progenitrici è un meccanismo importante che guida l'espansione del tessuto adiposo e disfunzione in risposta all'obesità. Capire i cambiamenti al tessuto adiposo perivascolare (PVAT) così è clinicamente rilevanti nella malattia metabolica. Tuttavia, gli studi precedenti sono stati prevalentemente eseguiti in altri animali e il mouse modelli. Questo protocollo utilizza campioni a PVAT toracici umani raccolti da pazienti sottoposti a chirurgia dell'innesto di bypass coronarico. Tessuto adiposo dall'aorta ascendente è stato raccolte e utilizzato per espianto della frazione vascolare stromal. Abbiamo precedentemente confermato la presenza di cellule progenitrici adipose in PVAT umano con la capacità di differenziarsi in contenenti lipidi adipociti. In questo studio, abbiamo analizzato ulteriormente il potenziale di differenziazione delle cellule dalla frazione vascolare stromal, presumibilmente contenente cellule progenitrici multi-potente. Abbiamo confrontato le cellule derivate da PVAT al midollo osseo umano MSC per differenziazione in adipogenico, osteogenica e condrogenica lignaggi. Dopo 14 giorni di differenziazione, macchie specifiche sono state utilizzate per rilevare l'accumulo di lipidi negli adipociti (O olio rosso), i depositi calcificanti in cellule osteogeniche (Alizarin Red.), o di glicosaminoglicani e di collagene nelle cellule condrogenica (Trichrome di Masson). Mentre midollo osseo MSC differenziate in modo efficiente in tutti e tre i stirpi, cellule derivate da PVAT avevano adipogenico e condrogenica potenziale, ma mancava il potenziale osteogenico robusto.
Introduzione
Il tessuto adiposo è una ricca fonte di multi-potente cellule staminali mesenchimali (MSC) in grado di differenziarsi in osteogenica, adipogenico e condrogenica lignaggi1. Questo tessuto si espande attraverso l'ipertrofia dei adipocytes maturi e de novo differenziazione delle MSC residente ai adipocytes. Tessuto adiposo perivascolare (PVAT) circonda i vasi sanguigni e regola la funzione vascolare2,3. Espansione di PVAT indotta da obesità aggrava patologie cardiovascolari. Mentre il potenziale multipotente di MSC da depositi adiposi sottocutanei umani sono stati ben studiato
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Protocollo
L'uso di tessuti umani in questo studio è stato valutato e approvato dall'istituzionale Review Board del Maine Medical Center, e tutto il personale ha ricevuto una formazione adeguata prima della sperimentazione.
1. preparati
- Rendere dissociazione buffer mediante ricostituzione 50mg privo di animale collagenasi/dispase ho miscela soluzione con 1 mL di soluzione di lavoro 1 mg/mL di nanopure H2O. preparare aggiungendo 49 mL di alto glucosio DMEM contenente 1% w/v BSA per la collagenosi ricostituita / soluzione di dispase. Conservare le aliquote di lavoro di 5 mL a-20 ° C e riscaldare a 37 ° C, utilizzando una prima vasca....
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Risultati
Isolamento della frazione stromale vascolare da PVAT umano
Figura 1A Mostra un disegno schematico della regione anatomica dove il PVAT sovrastante l'aorta ascendente è stata ottenuta. Precedentemente abbiamo descritto le popolazioni di pazienti sottoposti a bypass coronarico da cui questi campioni erano derivate6. Figura 1B Mostr.......
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Discussione
Cellule progenitrici adipose da depositi differenti variano ampiamente nel fenotipo e differenziazione potenziali9. Coltura progenitori PVAT-derivati da un singolo donatore paziente in simultanea induzione giù tre stirpi differenti, adipogenico, osteogenica e condrogenica, permette un'indagine ben controllata della capacità pluripotenti di questo romanzo popolazione di cellule progenitrici. La metodologia descritta in questo rapporto può essere utilizzata per verificare la capacità di differenziaz.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo l'assistenza di ricerca navigazione a Maine Medical Center per assistere l'assicurato nella ricerca del tessuto clinico, istopatologia e istomorfometria Core (supportato da 1P20GM121301, L. Liaw PI) a Maine Medical Center Research Istituto per sezionamento e colorazione. Questo lavoro è stato supportato da NIH concedere HL141149 R01 (Liaw L.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Miscela di collagenasi/dispasi senza animali | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Soluzione acquosa pH 2,5 |
| Alizarina Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Anilina Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| Antibiotico/antimicotico | ThermoFisher | 15240062 | |
| Acido scarlatto di Beibrich fucsina | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glicerofosfato | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlatto | EKI | 2248-25G | |
| Biotina | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Fissativo di Bouin | NewComerSupply | 1020A | |
| Bovino albumina sierica | Calbiochem | 12659 | conservata a 4 gradi Soluzione |
| di distacco di cellule | Accutase | AT104 | |
| Filtro a campana (70 mm) | Corning | 352350 | |
| Desametasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4,5 g/L di glucosio, L-glut e piruvato |
| DMEM/F12 medio | ThermoFisher | 10565-042 | alto glucosio, glutamax, sodio bicarbinato |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| Siero fetale bovino | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| Formalina | NewComerSupply | 1090 | |
| Gelatina, pelle bovina | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | integratore di glutammina |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| Soluzione di insulina | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Olio rosso O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| Acido pantotenico | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Soluzione di acido fosfotungstico/fosfolibdico | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Reagente antimicrobico per terreni di coltura. |
| Rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Ematossilina di Weigert | EKI | 4880-100G |
Riferimenti
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C.
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Ristampe e permessi
