CRISPR/Cas12a 系统与单个 crRNA 阵列相结合,可同时在多个位点对S. cerevisae基因组进行高效的多路复用编辑。这通过构建产生酵母菌株的类胡萝卜素来证明,这些菌株随后用于创建酵母像素艺术。
高效率、易用性和多功能性的集群定期间隔短纤维重复/CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统促进了高级基因改造的糖霉素,一个模型工业生物技术中的有机体和主力。CRISPR相关蛋白12a(Cas12a),一种RNA引导的内切酶,其特征与Cas9不同,因此进一步扩展了用于基因组编辑的分子工具箱。CRISPR/Cas12a系统的一个优点是,它可用于多路基因组编辑,从单个转录单元(单个CRISPRRNA(crRNA)阵列表达的多个导导RNA。我们使用CRISPR/Cas12a系统,用单个crRNA阵列构造表达的多个crRNA表达的CRISPR/Cas12a系统,提出了一种将多个异构基因多路整合到S.cerevisae基因组独立位点的方案。该方法利用S.cerevisae在体内对DNA片段进行重组的能力,将单个crRNA阵列组装成一个质粒,可用于转化剂选择,以及供体DNA的组装以预期位置集成到基因组中的序列。Cas12a 是预先表达的构成,在单crRNA阵列的表达时,促进S.cerevisae基因组在预期位置的裂解。该协议包括设计和构建单个crRNA阵列和供体DNA表达盒,并利用独特的50bpDNA连接器序列和单独的集成侧翼DNA序列的集成方法,简化了实验设计通过标准化和模块化,并扩展了应用范围。最后,我们演示了一种简单的技术,即使用声学液体处理程序创建酵母像素艺术,使用不同颜色的类胡萝卜素生成构建的酵母菌株。
CRISPR/Cas酶无疑已经彻底改变了分子生物学,并被广泛地用作工程基因组的工具,其速度以前是不可行的。DiCarlo等人报告了CRISPR/Cas9基因组编辑系统对糖霉菌基因组的首次修改。2、使用外部引入的寡核苷酸证明成功的基因敲除和进行点突变。进一步的酵母CRISPR工具箱发展包括:通过融合催化非活性死亡Cas9(dCas9)与转录效应器域的转录调节,使转录3的激活和沉默,适用于两者基因组编辑和调节功能代谢通路工程通过同时激活,抑制和删除4,从S.cerevisae基因组5删除大片段,和多染色体融合6.
CRISPR/Cas基因组编辑系统在细菌和古生物的适应性免疫系统中找到了它们的起源,这些系统已被分子生物学家用于基因组编辑。其功能基于聚类定期间隔短单体重复 (CRISPR) DNA 区域编码 RNA 负责识别外来 DNA 或 RNA 和 CRISPR 相关基因 (Cas), 编码RNA引导内西西莱西1,7,8,9 。根据最近对CRISPR/Cas系统的基因组分析,建议将CRISPR/Cas系统划分为两个类、5个类型和16个亚型10。这两个类根据目标裂解中涉及的效应复合物的组织进行区分。通常,具有多子单元组织的 CRISPR/Cas 系统被归类为类 1,而单个子单元效应器复合体属于类 210,11。在本文中,我们将探讨 2 类 V Cas12a,以前称为 Cpf110,12,这是 2 类 II Cas9 的替代方法。虽然Cas9具有很好的特征,并广泛用于研究,Cas12a提供了附加功能12。首先,Cas12a与CRISPRRNA(crRNA)形成42至44个核苷酸的复合物,无需额外的转活CRISPRRNA(tracrRNA)。因此,与CRISPR/Cas9相比,CRISPR/Cas12a系统可用于基因组编辑,较短的导引RNA。其次,Cas12a独特的内西酸酶和内分酶活性使其在crRNA13前成熟。此 RNase 活性允许在单个 CRISPR crRNA 阵列上编码多个 crRNA,而 Cas9 要求每个所谓的单导RNA (sgRNA) 的单独表达,或者例如附加内切酶的表达(例如,Csy4)结合识别图案的Csy4围绕每个sgRNA14,15。第三,Cas12a 目标站点识别需要从目标位于 5′ 端的原型空间相邻图案 (PAM),并在 PAM 的 ±18/+23 位置后从其 PAM 上分离,导致带有粘性端的 DNA 被分离,而 Cas9 要求 PAM 位于 3′ 端从目标并切割后-3位置创建钝端削减在DNA12。第四,PAM的共识核苷酸序列在Cas12a(T)TTV和Cas9(NGG)之间有所不同,这使得Cas12a成为瞄准T-富启动子和终结者序列16的有希望的候选者。最后,最近的一项研究报告,Cas12a的目标特异性比原生Cas917更大。
我们提出了使用CRISPR/Cas12a系统进行S.cerevisae基因组编辑的协议,特别注重将多个DNA表达盒同时引入独立的基因组位点(多路基因组编辑)。单个 crRNA 阵列。协议的关键步骤如图1所示。作为概念的证明,CRISPR/Cas12a系统应用于将三个表达盒引入S.cerevisae的基因组,从而能够生产如图2所示的β-胡萝卜素18。β-胡萝卜素的产生影响S.cerevisae的表型:即,在成功引入类胡萝卜素生物合成所需的所有三个异源基因后,白色S.cerevisae细胞变成黄色或橙色,取决于每个基因的启动子的表达强度。由于该通路的视觉读出简单,已引入开发先进的基于CRISPR的系统和方法,用于基因组编辑19,20。在这项工作中,编码类胡萝卜素基因crtE、crtYB和crtI的表达盒使用金门克隆(GGC)方法21与异源启动子和同源终止器用于驱动基因的表达。表达盒周围有独特的 50 碱基对 (bp) 序列,称为连接器,允许具有相同 50 bp 序列的集成侧翼 DNA 序列(侧翼区域)的体内组装,以及后续集成在侧翼区域确定的位置进入酵母的基因组DNA。通过使用不同的促进剂强度,获得不同水平的类胡萝卜素生产菌株,导致细胞颜色的变化。这些菌株-灵感来自”酵母艺术项目”22 – 用于一个斑点设置与声学液体处理程序,以创建罗莎琳德富兰克林的4色高分辨率”酵母照片”。富兰克林(1920-1958)是英国化学家和X射线晶体学家,以她对第5123、24、25号DNA结构的发现做出了贡献而闻名。
所提供的协议描述了使用来自Lachnospiracea细菌的Cas12a与单个crRNA阵列和供体DNA相结合的S.cerevisae的多路基因组编辑。详细介绍了单crRNA阵列和供体DNA的设计。与成熟的CRISPR/Cas9系统相比,CRISPR/Cas12a具有独特的额外能力,能够处理从单个crRNA阵列13、33中表达的多个crRNA。由于此功能,同时编辑多个目标更易于设置,并且可以在单个转换中实现。Zetsche等人之前已经演示了这种单一crRNA阵列方法。34人使用AsCas12a和Swiat等人同时编辑了哺乳动物细胞中的多达4个基因。35人使用FnCas12a将4个DNA片段引入酵母基因组。据我们所知,使用 Cas12a 系统同时进行的基因组修饰数量更多,并且 Cas12a 每个阵列的目标最大限值尚未确定。进一步的研究利用单crRNA阵列结合Cas12a包括多路转录调节在广泛的生物33,36,37。
在所呈现的协议中有一些关键步骤。仔细设计Cas12a基因组编辑实验中涉及的所有DNA序列,特别是在引入新型DNA序列的情况下。确定crRNA中新的间隔序列部分的功能,例如通过Verwaal等人描述的单丛基因组编辑实验。19之前将它们组合到单个 crRNA 阵列中。按照 Cas12a 编辑实验中使用的转换缓冲液制备的建议,实现酵母的良好转化效率。
技术有一些可选的修改。建议在转化中使用每个供体DNA的1μg、线性化pRN1120或单crRNA阵列表达盒,尽管使用较低的DNA量也有望产生令人满意的转化效率。执行测试转换以确定是否可以使用较低的 DNA 量。S. cerevisae的转换可能使用与该协议中描述的方法不同的方法执行,例如 Gietz等人描述的协议。(2007)38.导引RNA受体质粒pRN1120适用于不同Cas12a变异的单个crRNA和单crRNA阵列的表达(例如,来自酸米诺卡丘spp)。BV3L6或方济各会诺维西达U112),以及表达sgRNA结合Cas919。供体DNA不需要局限于类胡萝卜素基因表达盒和侧翼区域,目标为基因组DNA中所述的INT1、INT2和INT3位点。任何感兴趣的DNA都可以通过该协议中描述的设计原则以多路复用的方式引入宿主的基因组DNA,或者供体DNA可用于从宿主基因组中删除DNA。单crRNA阵列的模块化结构便于调整间隔和直接重复序列。间隔序列的修改允许改变预定的集成位点,可以通过一个用于识别基因组目标位点的工具来设计,例如GuideScan软件1.0 39。通过将这些 50 bp 齿面区域序列纳入 PCR 中使用的引体中,可以将 50 bp 的齿面区域序列纳入供体 DNA 序列,而不是使用包含连接器序列的大型齿面序列。在这种情况下,一个成功的多路复用基因组编辑实验总共只需要三个,而不是九个供体DNA片段。
总之,该协议提供了分步方向,使用Cas12a与单个crRNA阵列方法相结合,在S.cerevisae中执行多路复用基因组编辑。该协议通过使用9个供体DNA片段和3个gRNA的单crRNA阵列编码进行多路基因组编辑。对于此处报告的三种应变设计,我们显示高达 50% 到 94% 的总体编辑频率。最后,Cas12a 的独特功能是能够将单个 crRNA 阵列处理成细胞中的单个 crRNA,这使得 Cas12a 成为实现多路复用基因组编辑和开发针对多个表达盒在一去。最后,获得三种菌株,在不同水平和黄色和橙色之间的色调下生产类胡萝卜素。有了这些菌株和野生型菌株,我们展示了如何直接使用声学液体处理机制作酵母像素艺术 – 这是为了纪念罗莎琳德·富兰克林,她65年前通过她著名的照片51 23.为发现DNA结构做出了贡献。/c1°.
The authors have nothing to disclose.
该项目根据第686070号(DD-DeCaf)和764591(SynCrop)赠款协议,从欧洲联盟的Horizon 2020研究和创新方案获得资金,以及项目号为737.016.005(SynCrop)的研究方案”生命组成部分”,项目号为737.016.005荷兰科学研究组织(NWO)。T.E.G.得到了英国皇家学会(授予UF160357)和BBSRC/EPSRC合成生物学研究中心(资助BB/L01386X/1)的支持。我们感谢齐迪和杰弗里·范·维克克为酵母发现实验所做出的贡献,他们创造了酵母像素艺术。
Chemicals specific for the protocol | |||
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | Electrophoresis |
Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Selection of E. coli transformants |
BsaI-HF (20 U/µl) | New England BioLabs | R353L | Golden Gate Cloning |
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
CutSmart Buffer | New England BioLabs | B7204S | Linearization of pRN1120 |
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma Aldrich | D1626 | Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA) |
dNTPs | Invitrogen | 10297018 | PCRs |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Linearization of pRN1120 |
Ethanol absolute for analysis | Merck | 100983 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Ethylenediamine-tetraacetic acid | Sigma Aldrich | ED | Transformation of S. cerevisiae |
G418 disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Histodenz | Sigma Aldrich | D2158 | Yeast pixel art |
Isopropanol | Merck | 100993 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Lithium acetate dihydrate | Sigma Aldrich | L6883 | Transformation of S. cerevisiae |
Nancy-520 DNA Gel Stain | Sigma Aldrich | 1494 | Electrophoresis |
NEB10 competent E. coli cells | New England BioLabs | C3019H | Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6 |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB102 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Phusion buffer | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Polyethylene glycol 4000 | Merck | 7490 | Transformation of S. cerevisiae |
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Purple loading dye | New England BioLabs | B7024S | Electrophoresis |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Purification of plasmids |
RNase coctail enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | Golden Gate Cloning |
T4 DNA Ligase (1 U/µl) | Invitrogen | 1705218 | Golden Gate Cloning |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | Electrophoresis |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit | Promega | A9282 | Purification of PCR products and linearized pRN1120 |
Xhol | New England BioLabs | R0146S | Linearization of pRN1120 |
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) | Zymo Research | E1006 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme) |
Zymolyase storage buffer | Zymo Research | E1004-B | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme) |
Chemicals of general use | |||
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar | Plate growth of E. coli | ||
2*PY medium | Cultivation of E. coli | ||
Demineralized water | Transformation of S. cerevisiae |
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ELFO buffer | Electrophoresis | ||
MQ | Multiple steps | ||
Physiological salt solution | Transformation of S. cerevisiae |
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TE buffer | Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae | ||
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | Cultivation of S. cerevisiae | ||
YEPD (2% glucose) agar | Plate growth of S. cerevisiae |
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Consumables | |||
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes (50 mL) | |||
Microplate 96 wells | |||
Petri dishes | |||
Pipette tips 0.5 – 10 µL | |||
Pipette tips 10 – 200 µL | |||
Pipette tips 100 – 1000 µL | |||
Shake flasks (500 mL) | |||
Sterile filters | |||
Equipment | |||
Centrifuge (Falcon tubes) | |||
Echo 525 acoustic liquid handler | |||
Incubator | |||
NanoDrop | |||
Set for eletrophoresis | |||
Spectrophotometer | |||
Table centrifuge (Eppendorfs tubes) | |||
Thermocycler | |||
Plasmids | |||
pCSN067 | Addgene | ID 101748 | https://www.addgene.org/ |
pRN1120 | Addgene | ID 101750 | https://www.addgene.org/ |
Strains | |||
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D |
EUROSCARF collection | http://www.euroscarf.de |