O sistema CRISPR/Cas12a em combinação com uma única matriz crRNA permite a edição multiplex eficiente do genoma S. cerevisiae em vários locos simultaneamente. Isto é demonstrado pela construção de carotenóides produzindo cepas de levedura que são subsequentemente utilizados para criar a arte do pixel de levedura.
Alta eficiência, facilidade de uso e versatilidade das repetições palindrômicas curtas interespaçadas agrupadas/proteína 9 (CRISPR/Cas9) associada ao sistema CRISPR-Associated tem facilitado a modificação genética avançada de Saccharomyces cerevisiae, um modelo organismo e laborioso em biotecnologia industrial. Proteína 12A associada a CRISPR (Cas12a), uma endonuclease guiada por RNA com características distinguíveis de Cas9 é aplicada neste trabalho, estendendo ainda mais a caixa de ferramentas molecular para fins de edição de genoma. Um benefício do sistema CRISPR/Cas12a é que ele pode ser usado na edição do genoma multiplex com várias RNAs de guia expressas a partir de uma única unidade transcricional (única matriz de RNA CRISPR (crRNA)). Nós apresentamos um protocolo para a integração multiplex de genes heterólogo múltiplos no locus independente do genoma de S. cerevisiae usando o sistema de crispr/Cas12a com os crrnas múltiplos expressados de uma única construção da disposição do crrna. O método proposto explora a capacidade de S. cerevisiae para realizar a recombinação in vivo de fragmentos de DNA para montar a matriz crrna única em um plasmídeo que pode ser usado para a seleção transformante, bem como a montagem de DNA doador sequências que se integram no genoma em posições pretendidas. Cas12a é pré-expresso constitutivamente, facilitando a clivagem do genoma de S. cerevisiae nas posições pretendidas após a expressão do único array crrna. O protocolo inclui o projeto e a construção de uma única matriz de crRNA e de gavetas fornecedoras da expressão do ADN, e explora uma aproximação da integração que faz o uso de seqüências originais dos conectores do ADN de 50-BP e de seqüências separadas do ADN do flanco da integração, que simplifica projeto experimental através de padronização e modularização e amplia a gama de aplicações. Finalmente, Nós demonstramos uma técnica direta para criar a arte do pixel do fermento com um alimentador líquido acústico usando o carotenóide diferentemente colorido produzindo as tensões do fermento que foram construídas.
As enzimas CRISPR/CAS revolucionaram inquestionavelmente a biologia molecular e foram amplamente adotadas como ferramentas para genomas de engenharia a uma velocidade que antes era inviável1. A primeira modificação de um genoma de Saccharomyces cerevisiae pelo sistema de edição de GENOMA crispr/Cas9 foi relatada por DiCarlo et al. 2, demonstrando sucesso gene knock-out e fazendo mutações ponto usando externamente introduzido oligonucleotides. Promova os desenvolvimentos da caixa de ferramentas de crispr do fermento incluíram: Regulamento do transcricional pela fusão de Cas9 inoperantes catalisador inoperante (dCas9) com os domínios do efetoras do transcricional para permitir a ativação e o silenciamento da transcrição3, aplicação para ambos edição do genoma e funções regulatórias para a engenharia da via metabólica por ativação simultânea, repressão e deleção4, deleção de grandes fragmentos do genoma S. cerevisiae 5e fusões de cromossomo múltiplos6 .
Os sistemas de edição de genoma CRISPR/CAS encontram sua origem em sistemas imunes adaptativos de bactérias e Archaea e esses sistemas foram adaptados por biólogos moleculares para edição de genoma. A sua funcionalidade baseia-se nas regiões de DNA das repetições Palindromicas curtas agrupadas regularmente Interespaçadas (CRISPR) que codificam o RNA responsável pelo reconhecimento do ADN ou RNA estrangeiro e dos genes associados CRISPR (CAS) que codifica a endonucleases1,7,8,9. Com base na recente análise do genoma dos sistemas CRISPR/CAS, foi proposto dividir os sistemas CRISPR/CAS em duas classes, cinco tipos e 16 subtipos10. As duas classes são distinguidas com base na organização de complexos efetores envolvidos na clivagem alvo. Tipicamente, os sistemas CRISPR/CAS com uma organização de várias subunidades são categorizados como classe 1, enquanto os complexos efetores de subunidades individuais pertencem à classe 210,11. Neste artigo, exploramos a classe 2 tipo V Cas12a, anteriormente denominada Cpf1,10,12, que é uma alternativa à classe 2 tipo II Cas9. Embora Cas9 seja bem caracterizado e amplamente utilizado na pesquisa, o Cas12a oferece recursos adicionais12. Em primeiro lugar, Cas12a forma um complexo com RNA CRISPR (crRNA) de 42 a 44 nucleotídeos sem a necessidade de um RNA CRISPR trans-ativador adicional (tracrRNA). Portanto, um RNA guia mais curto pode ser utilizado na edição do genoma com sistemas CRISPR/Cas12a em comparação com CRISPR/Cas9. Em segundo lugar, a atividade única de endonuclease e endorribonuclease de Cas12a possibilita a maturação de seu pré-crRNA13. Esta atividade de RNase permite a codificação de crRNAs múltiplo em uma única disposição do crRNA de CRISPR, visto que Cas9 exige a expressão separada de cada RNA so-called do único-guia (sgRNA) ou alternativamente para a expressão do exemplo de um endonuclease adicional ( por exemplo, Csy4) em combinação com motivos de reconhecimento para Csy4 em torno de cada sgrna14,15. Em terceiro lugar, Cas12a reconhecimento do local de destino requer um motivo adjacente de protoespaçador (PAM) na extremidade 5 ‘ do alvo e Cleaves após a posição + 18/+ 23 de seu PAM resultando em DNA clivada com extremidades pegajosas, enquanto que Cas9 requer um PAM localizado na extremidade 3 ‘ do alvo e Cleaves após a posição-3 que cria cortes sem corte da extremidade no ADN12. Em quarto lugar, a seqüência de nucleotídeo consensual do PAM difere entre Cas12a ((T) TTV) e Cas9 (NGG), o que torna Cas12a um candidato promissor para o direcionamento de T-Rich promotor e terminador seqüências16. Finalmente, um estudo recente relatou maior especificidade do alvo para Cas12a do que para o nativo Cas917.
Nós apresentamos um protocolo para usar o sistema de CRISPR/Cas12a para a edição do genoma de S. cerevisiae com um foco particular na introdução de gavetas múltiplas da expressão do ADN em Locus genomic independentes simultaneamente (edição multiplex do genoma) usando uma única matriz crRNA. As etapas-chave do protocolo são representadas na Figura 1. Como prova de conceito, o sistema CRISPR/Cas12a foi aplicado para introdução de três fitas de expressão no genoma de S. cerevisiae que possibilitam a produção de β-caroteno18 como esquematicamente mostrado na Figura 2. A produção de β-caroteno afeta o fenótipo de s. cerevisiae: ou seja, após a introdução bem-sucedida de todos os três genes heterólogos necessários para a biossíntese de carotenóides, as células brancas de s. cerevisiae se transformam em amarelo ou laranja, dependendo da força de expressão do promotor de cada gene. Devido à simples leitura visual desta via, foi introduzido para desenvolver sistemas avançados baseados em crispr e métodos para edição de genoma19,20. Neste trabalho, as gavetas da expressão que codificam os genes carotenóides CRTe, crtyb e crti foram construídas usando uma aproximação de Golden Gate clonagem (GGC)21 com promotores heterólogo e terminadores homólogos usado para conduzir a expressão dos genes. As fitas de expressão são rodeadas por sequências de pares 50-base (BP) exclusivas, chamadas de conectores, que permitem a montagem in vivo com sequências de DNA de flanco de integração (regiões flanqueadas) com as mesmas sequências 50-BP, e subsequente integração no ADN genomic do fermento na posição determinada pelas regiões flanqueando. Usando diferentes pontos fortes do promotor, foram obtidas cepas com diferentes níveis de produção de carotenóides, resultando em variação na cor das células. Estas estirpes-inspirado pelo “fermento Art Project”22 -foram usados em uma configuração spotting com um manipulador de líquido acústico para criar um 4-cor de alta resolução “levedura fotografia” de Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) foi um químico inglês e cristalografo de raios-X bem conhecido por sua contribuição para a descoberta da estrutura do DNA por foto 5123,24,25.
O protocolo fornecido descreve a edição multiplex do genoma de S. cerevisiae usando Cas12a de Lachnospiraceae bactéria ND2006 em combinação com uma única disposição do crrna e ADN do doador. O projeto do único array do crRNA e do ADN do doador é explicado em detalhe. Em contraste com o sistema crispr/Cas9 bem estabelecido, o crispr/Cas12a tem a capacidade adicional única de processar crrnas múltiplas expressas a partir de uma única matriz de crrna13,33. Devido a esse recurso, a edição simultânea de vários alvos é mais fácil de configurar e pode ser alcançada em uma única transformação. Esta única aproximação da disposição do crRNA foi demonstrada antes por Zetsche et al. 34 que, simultaneamente, editou até quatro genes em células de mamíferos usando AsCas12a, e por Swiat et al. 35 que introduziu quatro fragmentos de DNA em um genoma de levedura usando FnCas12a. A nosso conhecimento, um número mais elevado de modificações genomic simultâneas usando um sistema Cas12a não foi relatado e o limite máximo dos alvos por a única disposição para Cas12a é ainda ser determinado. Uma pesquisa mais adicional que utiliza únicas matrizes do crrna em combinação com o Cas12a inclui o Regulamento transcricional multiplex em uma escala larga dos organismos33,36,37.
Existem algumas etapas críticas no protocolo apresentado. Projete cuidadosamente todas as sequências de DNA envolvidas no experimento de edição do genoma Cas12a, especialmente no caso de novas sequências de DNA serem introduzidas. Determine a funcionalidade de novas sequências de espaçador parte de um crRNA, por exemplo, por um experimento de edição de genoma singleplex, conforme descrito por Verwaal et al. 19 antes de combiná-los em uma única matriz crrna. Siga as recomendações para a preparação de soluções de buffer de transformação usadas no experimento de edição Cas12a para alcançar uma boa eficiência de transformação do fermento.
Existem algumas modificações opcionais da técnica. Recomenda-se usar 1 μg de cada DNA de doador, pRN1120 linearizado ou única gaveta de expressão de matriz crRNA na transformação, embora o uso de uma menor quantidade de DNA também seja esperado para resultar em uma eficiência de transformação satisfatória. Realize uma transformação de teste para determinar se os valores de DNA inferiores podem ser usados. A transformação de S. cerevisiae pode ser realizada por meio de um método diferente daquele descrito neste protocolo, por exemplo, o protocolo descrito por gietz et al. (2007) 38. o plasmídeo receptor de RNA guia pRN1120 é adequado para a expressão de uma única matriz crrna e crrna única de diferentes variantes de Cas12a (por exemplo, de acidaminococcus spp. BV3L6 ou Francisella novicida U112) bem como para a expressão de sgrna em combinação com Cas919. O ADN do doador não precisa de ser limitado às gavetas da expressão de gene do carotenóide e às regiões flanqueando que visam o ADN do doador aos locais descritos do INT1, do INT2 e do INT3 no ADN genomic. Todo o ADN do interesse pode ser introduzido, em uma maneira multiplex, no ADN genomic do anfitrião pelos princípios de projeto descritos neste protocolo, ou alternativamente o ADN fornecedor pode ser usado para suprimir do ADN de um genoma do anfitrião. A estrutura modular do único array crRNA facilita o ajuste fácil do espaçador e sequências de repetição diretas. A modificação das sequências espaçadoras permite uma alteração do locus de integração pretendido que pode ser desenhado por uma das ferramentas para a identificação de um local de destino genómico, por exemplo , software guidescan 1,039. Em vez de usar grandes sequências de flanquear que contêm seqüências de conectores, 50-BP da região de flanqueamento pode ser incluído nas seqüências de DNA do doador incorporando essas seqüências de região de flanqueamento 50-BP nos primers usados na PCR. Neste caso, no total apenas três em vez de nove fragmentos de DNA de doadores são necessários para um experimento de edição de genoma multiplex bem-sucedido.
Em resumo, este protocolo fornece instruções passo a passo para executar a edição multiplex do genoma em S. cerevisiae usando Cas12a em combinação com uma única abordagem de matriz crrna. O protocolo foi demonstrado pela edição multiplex do genoma usando 9 fragmentos do ADN do doador e a única codificação da disposição do crRNA para três gRNAs. Mostramos altas frequências de edição global entre 50% e 94% para os três designs de estirpe relatados aqui. Concluindo, a característica única do Cas12a é a capacidade de processar uma única matriz crRNA em crRNAs individuais em uma célula, o que torna Cas12a uma excelente ferramenta para permitir a edição de genoma multiplex e desenvolver módulos de regulação transcricional visando vários fitas de expressão de uma só vez. No final, três cepas foram obtidas produzindo carotenóides em um nível diferente e cores em tons entre amarelo e laranja. Com essas cepas e uma estirpe de tipo selvagem, mostramos como um manipulador de líquido acústico pode ser usado de forma direta para fazer a arte de pixel de levedura – isso em homenagem a Rosalind Franklin que contribuiu para a descoberta da estrutura do DNA 65 anos atrás por sua famosa foto 5123 .
The authors have nothing to disclose.
Este projecto recebeu financiamento do programa de investigação e inovação Horizon 2020 da União Europeia, a Convenção de subvenção n. º 686070 (DD-DeCaf) e 764591 (SynCrop), e do programa de investigação Building Blocks of Life com o número de projecto 737.016.005 por da organização neerlandesa de investigação científica (NWO). T foi apoiado pela sociedade real (Grant UF160357) e BrisSynBio, um centro de pesquisa de biologia sintética BBSRC/EPSRC (Grant BB/L01386X/1). Agradecemos Zi di e Jeffrey Van Wijk por sua contribuição para as experiências de manchas de levedura para criar a arte de pixel de levedura.
Chemicals specific for the protocol | |||
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | Electrophoresis |
Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Selection of E. coli transformants |
BsaI-HF (20 U/µl) | New England BioLabs | R353L | Golden Gate Cloning |
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
CutSmart Buffer | New England BioLabs | B7204S | Linearization of pRN1120 |
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma Aldrich | D1626 | Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA) |
dNTPs | Invitrogen | 10297018 | PCRs |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Linearization of pRN1120 |
Ethanol absolute for analysis | Merck | 100983 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Ethylenediamine-tetraacetic acid | Sigma Aldrich | ED | Transformation of S. cerevisiae |
G418 disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Histodenz | Sigma Aldrich | D2158 | Yeast pixel art |
Isopropanol | Merck | 100993 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Lithium acetate dihydrate | Sigma Aldrich | L6883 | Transformation of S. cerevisiae |
Nancy-520 DNA Gel Stain | Sigma Aldrich | 1494 | Electrophoresis |
NEB10 competent E. coli cells | New England BioLabs | C3019H | Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6 |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB102 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Phusion buffer | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Polyethylene glycol 4000 | Merck | 7490 | Transformation of S. cerevisiae |
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Purple loading dye | New England BioLabs | B7024S | Electrophoresis |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Purification of plasmids |
RNase coctail enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | Golden Gate Cloning |
T4 DNA Ligase (1 U/µl) | Invitrogen | 1705218 | Golden Gate Cloning |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | Electrophoresis |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit | Promega | A9282 | Purification of PCR products and linearized pRN1120 |
Xhol | New England BioLabs | R0146S | Linearization of pRN1120 |
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) | Zymo Research | E1006 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme) |
Zymolyase storage buffer | Zymo Research | E1004-B | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme) |
Chemicals of general use | |||
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar | Plate growth of E. coli | ||
2*PY medium | Cultivation of E. coli | ||
Demineralized water | Transformation of S. cerevisiae |
||
ELFO buffer | Electrophoresis | ||
MQ | Multiple steps | ||
Physiological salt solution | Transformation of S. cerevisiae |
||
TE buffer | Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae | ||
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | Cultivation of S. cerevisiae | ||
YEPD (2% glucose) agar | Plate growth of S. cerevisiae |
||
Consumables | |||
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes (50 mL) | |||
Microplate 96 wells | |||
Petri dishes | |||
Pipette tips 0.5 – 10 µL | |||
Pipette tips 10 – 200 µL | |||
Pipette tips 100 – 1000 µL | |||
Shake flasks (500 mL) | |||
Sterile filters | |||
Equipment | |||
Centrifuge (Falcon tubes) | |||
Echo 525 acoustic liquid handler | |||
Incubator | |||
NanoDrop | |||
Set for eletrophoresis | |||
Spectrophotometer | |||
Table centrifuge (Eppendorfs tubes) | |||
Thermocycler | |||
Plasmids | |||
pCSN067 | Addgene | ID 101748 | https://www.addgene.org/ |
pRN1120 | Addgene | ID 101750 | https://www.addgene.org/ |
Strains | |||
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D |
EUROSCARF collection | http://www.euroscarf.de |