CRISPR/Cas12a sistemi, tek bir crRNA dizisi ile birlikte aynı anda birden çok loci ‘de S. cerevisiae genomunun verimli çok katmanlı düzenlemesini sağlar. Bu daha sonra Maya piksel sanatı oluşturmak için kullanılan karotenoid üreten maya suşları oluşturarak gösterilmiştir.
Yüksek verimlilik, kullanım kolaylığı ve çok yönlülük kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarlar/Crispr ilişkili protein 9 (Crispr/Cas9) sistemi, bir model, Saccharomyces cerevisiaegelişmiş genetik modifikasyon kolaylaştırdı Endüstriyel Biyoteknoloji içinde organizma ve beygir. Crispr ilişkili protein 12A (Cas12a), RNA destekli bir endonükleaz ile Cas9 ‘den ayırt edilen özelliklerle bu çalışmanın uygulandığı, daha da genom düzenleme amaçları için moleküler Toolbox genişletme. Crispr/Cas12a sisteminin bir yararı, tek bir transkripsiyonel üniteden (tek Crispr RNA (crrna) dizisi) ifade edilen birden fazla kılavuz Rnas ile Multiplex genom düzenlemede kullanılabilirler. Birden fazla heterolog genlerin Multiplex entegrasyonu için, tek bir crrna dizi yapısına göre birden fazla crrnas içeren Crispr/Cas12a sistemini kullanarak S. cerevisiae jenomunun bağımsız lokasyonuna yönelik bir protokol sunuyoruz. Önerilen yöntem, S. cerevisiae ‘nin, tek crrna dizisini, transformant seçimi için kullanılabilecek bir Plasmid haline getirmek IÇIN, DNA parçalarının içinde vivo olarak yeniden kombinasyonunu gerçekleştirmesini ve donör DNA ‘sının montajına yönelik yeteneğini kullanıyor. istenilen konumlarda genom entegre dizileri. Cas12a, tek crRNA dizisinin ifadesi üzerine amaçlanan pozisyonlarda S. cerevisiae genomunu kolaylaştırarak, seçiciyle önceden ifade edilir. Protokol, tek bir crRNA dizisi ve bağışçı DNA ifade kasetlerinin tasarımını ve inşası içerir ve benzersiz 50-BP DNA konnektörleri dizileri ve ayrı entegrasyon kanat DNA dizileri kullanımı yapma bir entegrasyon yaklaşımı kullanır, hangi basitleştirir standardizasyon ve modülarizasyon ile deneysel tasarım ve uygulama aralığını genişletir. Son olarak, biz inşa edildi farklı renkli karotenoid üreten maya suşları kullanarak bir akustik sıvı işleyici ile Maya piksel sanatı oluşturmak için basit bir teknik göstermektedir.
CRISPR/CAS enzimleri açıkça moleküler biyoloji devrim ve yaygın olarak daha önce imkansız1bir hızda mühendislik genomlar için araçlar olarak kabul edilmiştir. CRISPR/Cas9 genom düzenleme sistemi tarafından bir Saccharomyces cerevisiae genomu Ilk değişiklik DiCarlo ve Al tarafından rapor edildi . 2, başarılı gen knock-out gösteren ve dışarıdan ortaya oligonükleotidler kullanarak nokta mutasyonları yapma. Daha fazla Maya jıtpr Toolbox gelişmeler dahil: katalytically aktif ölü Cas9 (dCas9) füzyon tarafından transkripsiyonel düzenleme aktivasyon ve transkripsiyon susturma etkinleştirmek için transkripsiyonel efektör etki ile3, uygulama her ikisi için eşzamanlı aktivasyon, baskı ve silme4ile metabolik yol mühendisliği için genom düzenleme ve düzenleyici fonksiyonlar, S. cerevisiae genom5‘ ten büyük parçaların silinmesi ve çoklu kromozom Fusions6 .
CRISPR/CAS genom düzenleme sistemleri, bakterilerin ve antik çağların adaptif bağışıklık sistemlerinde kökenlerini bulur ve bu sistemler genom düzenleme için moleküler biyologlar tarafından adapte edilmiştir. Bunların işlevselliği, yabancı DNA veya RNA ‘nın tanınması için sorumlu RNA kodlamasını içeren kümelenmiş düzenli ara aralıklı kısa Palindromic tekrarlar (CRıNPR) DNA bölgeleri ve RNA destekli endonükleases1,7,8,9. CRISPR/CAS sistemlerinin son genom analizine dayanarak, CRISPR/CAS sistemlerini iki sınıf, beş tip ve 16 alt tip10‘ a bölmek önerilmiştir. İki sınıf hedef bölünme dahil efektör kompleksleri organizasyonu dayalı ayırt edilir. Tipik olarak, Multi-altbirim örgütlü Crispr/CAS sistemleri Sınıf 1 olarak sınıflandırılır, ancak tek altbirim efektör kompleksler 210,11sınıfına aittir. Bu yazıda, biz sınıf 2 türü V Cas12a, eski adı Cpf110,12, sınıf 2 türü II Cas9 alternatif olarak adlandırılan keşfedin. Cas9 iyi karakterize ve yaygın araştırmalarda kullanılan rağmen, Cas12a ek özellikler sunuyor12. Öncelikle, Cas12a, ek bir Trans-aktivasyonu CRISPR RNA (tracrRNA) gerektirmeden 42-44 nükleotidler CRISPR RNA (crRNA) ile bir kompleks oluşturur. Bu nedenle, Crispr/Cas9 ile kıyaslandığında daha kısa bir kılavuz RNA ‘nın genom düzenlemede CRISPR/Cas12a sistemleri ile kullanılabilir. İkincisi, Cas12a ‘in benzersiz endonükleaz ve endoribonuclease aktivitesi, crrna öncesi13‘ ün olgunlaşmasını sağlar. Bu RNase etkinliği, tek bir Crispr crrna dizisinde birden fazla crrnas ‘ın kodlamasını sağlar, ancak Cas9 her sözde tek kılavuzdaki RNA (sgrna) veya alternatif olarak örneğin ek bir endonükleaz ifadesi için ayrı bir ifade gerektirir ( Örneğin, Csy4) her sgrna14,15çevreleyen Csy4 için tanıma motifleri ile birlikte. Üçüncü olarak, Cas12a hedef site tanıma bir protospacer bitişik motif gerektirir (Pam) 5 ‘ sonunda hedef ve Cleaves sonra + 18/+ 23 pozisyon onun Pam yapışkan uçları ile parçalanabilen DNA sonucu, oysa Cas9 bir Pam üzerinde bulunan gerektirir 3 ‘ sonunda -3 pozisyondan sonra hedef ve Cleaves DNA12‘ de künt uç kesimleri yaratıyor. Fourthly, PAM ‘in uzlaşma nüklenotit dizisi Cas12a ((T) TTV) ve Cas9 (NGG) arasında farklılık gösterir ve bu da T zengin promotör ve Terminatör dizileri16‘ nın hedefleyen Cas12a için umut verici bir aday olur. Son olarak, yeni bir çalışmada Cas12a için yerel Cas917daha büyük hedef özgüllük bildirdi.
S. cerevisiae ‘nin genom düzenlemesi için Crispr/Cas12a sistemini kullanarak, bırden fazla DNA ifadesi kasetlerini bağımsız genomik loci ‘ye aynı anda (Multiplex genom düzenleme) giriş üzerine belirli bir odaklanma ile tanıtıyoruz tek bir crRNA dizisi. Protokol temel adımları Şekil 1‘ de tasvir edilir. Kavramsal bir kanıt olarak, Şekil 2‘ de şematik olarak gösterildiği gibi β-karoten18 üretimini sağlayan S. cerevisiae genomuna üç Ifade kasetleri giriş için Crispr/Cas12a sistemi uygulandı. Β-karoten üretimi s. cerevisiaefenotipini etkiler: yani, karotenoidler biyosentez için gerekli olan üç heterolog genlerin başarılı bir şekilde tanıtılması üzerine, beyaz S. cerevisiae hücreleri sarı veya turuncu açmak, Her gen organizör ifade gücüne bağlı olarak. Bu yolun basit görsel okumasının nedeniyle, genom düzenleme için gelişmiş Crispr tabanlı sistemler ve yöntemler geliştirmek için tanıtıldı19,20. Bu çalışma, karotenoid genler crte, crtyb ve crti kodlama ifade kasetleri bir Golden Gate klonlama (GGC) yaklaşımı21 heterolog rehberleri ve homolog sonlandırıcılar kullanılarak inşa edilmiştir genlerin ifade sürücü için kullanılır. İfade kasetleri, aynı 50-BP dizileri ile entegrasyon kanadı DNA dizileri (flanking bölgeleri) ile In vivo montaj için izin konektörler denilen benzersiz 50-baz çiftleri (BP) dizileri ile çevrilidir ve sonraki entegrasyon yan bölgeler tarafından belirlenen pozisyonda Maya genomik DNA içine. Farklı Organizatör güçleri kullanarak, farklı seviyelerde karotenoidler üretimi olan suşlar, hücrelerin renginde varyasyon elde edildi. Bu suşları-“Maya Sanat Projesi”22 esinlenerek-bir akustik sıvı işleyici ile bir lekeleme kurulum Rosalind Franklin 4 renkli yüksek çözünürlüklü “Maya fotoğraf” oluşturmak için kullanılmıştır. Franklin (1920-1958) bir İngiliz kimyager ve X-Ray kristalbilimciydi iyi fotoğraf 5123,24,25tarafından DNA yapısının keşfi için onun katkısı ile bilinmektedir.
Sağlanan protokol, tek bir crrna dizisi ve donör DNA ‘sı ile birlikte lachnospiraceae bakteri ND2006 Cas12a kullanarak S. cerevisiae Multiplex genom düzenleme açıklar. Tek crRNA dizi ve donör DNA tasarımı ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İyi kurulan Crispr/Cas9 sisteminin aksine, Crispr/Cas12a tek bir crrna dizisi13,33tarafından ifade edilen birden fazla crrnas işleme benzersiz ek yeteneği vardır. Bu özellik nedeniyle, birden çok hedefin eşzamanlı olarak düzenlenmesi daha kolaydır ve tek bir dönüşümde elde edilebilir. Bu tek crRNA dizi yaklaşımı önce Zetsche et altarafından gösterildi. 34 aynı anda AsCas12a kullanarak memeli hücrelerde dört gen kadar düzenlenmiş ve Swiat et al. 35 kullanarak FnCas12a bir Maya genomu IÇINE dört DNA parçaları tanıttı. Bilgimize göre, Cas12a sistemi kullanılarak eşzamanlı genomik değişikliklerin daha yüksek bir sayısı bildirilmemiştir ve Cas12a için tek bir dizi başına hedeflerin maksimal sınırı henüz belirlenemez. Cas12a ile birlikte tek crrna dizileri kullanan daha fazla araştırma organizmaların geniş bir yelpazede Multiplex transkripsiyon Yönetmeliği içerir33,36,37.
Sunulan protokolde bazı kritik adımlar vardır. Dikkatle Cas12a genom düzenleme deneyinde yer alan tüm DNA dizileri tasarlayın, özellikle yeni DNA dizileri tanıtıldı durumda. Yeni spacer dizileri bir crRNA parçası işlevselliğini belirlemek, örneğin bir singleplex genom düzenleme deneme tarafından açıklandığı gibi Verwaal ve Al. 19 onları tek bir crrna dizisine birleştirmeden önce. Maya iyi bir dönüşüm verimliliği elde etmek için Cas12a düzenleme denemede kullanılan dönüşüm tampon çözümleri hazırlanması için önerileri izleyin.
Teknik bazı isteğe bağlı değişiklikler vardır. Daha düşük bir DNA miktarının kullanımı da tatmin edici bir dönüşüm verimliliğine neden olması beklenmesine karşın, her bir donör DNA ‘sının 1 μg ‘sini, dönüşümde pRN1120 veya tek crRNA dizi ifade kaseti kullanmak tavsiye edilir. Daha düşük DNA miktarlarının kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için bir test dönüşümü gerçekleştirin. S. cerevisiae ‘nin dönüşümü, örneğin Gietz et al tarafından açıklanan protokol gibi, bu protokolde açıklanan farklı bir yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir. (2007) 38. kılavuz RNA alıcısı Plasmid pRN1120, tek bir crrna ve farklı Cas12a türevleri (Örneğin, Acidaminococcus spp. ) tek bir crrna dizisinin ifadesi için uygundur. BV3L6 veya Francisella novicida U112) yanı sıra Cas919Ile birlikte sgrna ifadesi için. Donör DNA ‘sı, genomik DNA ‘daki INT1, INT2 ve INT3 sitelerine donör DNA ‘yı hedefleyen karotenoid gen ifade kasetleri ve çevrelerle sınırlı olmak zorunda değildir. İlgi herhangi bir DNA, çok katmanlı bir şekilde, bu protokolde açıklanan tasarım ilkeleri ile ev sahibinin genomik DNA, ya da alternatif olarak bağışçı DNA bir ev sahibi genom DNA silmek için kullanılabilir sunulabilir. Tek crRNA dizisinin modüler yapısı, spacer ve doğrudan tekrarlama sıralarının kolay ayarlanmasını kolaylaştırır. Spacer dizileri modifikasyon bir genomik hedef sitenin tanımlanması için araçlardan biri tarafından tasarlanmış olabilir amaçlanan entegrasyon Locus bir değişiklik için izin verir, Örneğin guidescan yazılım 1,039. Bağlayıcı dizileri içeren büyük yan dizileri kullanmak yerine, 50-BP yan bölgenin bu 50-BP yan bölge sıraları PCR kullanılan primerler ekleyerek donör DNA dizileri dahil edilebilir. Bu durumda, başarılı bir Multiplex genom düzenleme deneyi için dokuz donör DNA parçası yerine Toplam sadece üç tane gereklidir.
Özetle, bu protokol, tek bir crRNA dizi yaklaşımı ile birlikte Cas12a kullanarak S. cerevisiae ‘de Multiplex genom düzenlemeyi gerçekleştirmek için adım adım yönergeler sağlar. Protokol, 9 bağışçı DNA parçaları ve üç gRNAs için tek crRNA dizi kodlaması kullanılarak Multiplex genom düzenleme tarafından gösterilmiştir. Burada bildirilen üç gerinim tasarımları için% 50 ile% 94 arasında yüksek genel düzenleme frekansları gösteriyoruz. Cas12a ‘in benzersiz özelliği, tek bir crRNA dizisini bir hücredeki bireysel crRNAs ‘a işleme yeteneğidir, bu da Cas12a Multiplex genom düzenlemesini sağlamak ve birden çok özelliği hedefleyen transkripsiyon düzenleme modülleri geliştirmek için mükemmel bir araçtır. tek kerede ifade kasetleri. Sonunda, farklı bir seviyede karotenoidler üreten üç suşlar ve sarı ve turuncu arasındaki tonlarında renkler elde edildi. Bu suşları ve vahşi tip gerinim ile, nasıl bir akustik sıvı işleyici düz Maya piksel sanat yapmak için kullanılabilir gösterdi-Rosalind Franklin onuruna bu DNA yapısının keşfi katkıda 65 yıl önce onun ünlü fotoğraf 5123 .
The authors have nothing to disclose.
Bu proje, Avrupa Birliği ‘nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı No. 686070 (DD-DeCaf) ve 764591 (SynCrop) altında ve proje numarası 737.016.005 tarafından araştırma programı yaşam taşları yapı tarafından fon aldı Hollanda bilimsel araştırmalar Örgütü (NWO). T.E.G. Royal Society (Grant UF160357) ve BrisSynBio, bir BBSRC/EPSRC sentetik biyoloji araştırma merkezi (Grant BB/L01386X/1) tarafından destekleniyordu. Biz Maya piksel sanatı oluşturmak için Maya lekeleme deneyler için katkısı Zi di ve Jeffrey van Wijk teşekkür ederiz.
Chemicals specific for the protocol | |||
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | Electrophoresis |
Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Selection of E. coli transformants |
BsaI-HF (20 U/µl) | New England BioLabs | R353L | Golden Gate Cloning |
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
CutSmart Buffer | New England BioLabs | B7204S | Linearization of pRN1120 |
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma Aldrich | D1626 | Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA) |
dNTPs | Invitrogen | 10297018 | PCRs |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Linearization of pRN1120 |
Ethanol absolute for analysis | Merck | 100983 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Ethylenediamine-tetraacetic acid | Sigma Aldrich | ED | Transformation of S. cerevisiae |
G418 disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Histodenz | Sigma Aldrich | D2158 | Yeast pixel art |
Isopropanol | Merck | 100993 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Lithium acetate dihydrate | Sigma Aldrich | L6883 | Transformation of S. cerevisiae |
Nancy-520 DNA Gel Stain | Sigma Aldrich | 1494 | Electrophoresis |
NEB10 competent E. coli cells | New England BioLabs | C3019H | Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6 |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB102 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Phusion buffer | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Polyethylene glycol 4000 | Merck | 7490 | Transformation of S. cerevisiae |
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Purple loading dye | New England BioLabs | B7024S | Electrophoresis |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Purification of plasmids |
RNase coctail enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | Golden Gate Cloning |
T4 DNA Ligase (1 U/µl) | Invitrogen | 1705218 | Golden Gate Cloning |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | Electrophoresis |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit | Promega | A9282 | Purification of PCR products and linearized pRN1120 |
Xhol | New England BioLabs | R0146S | Linearization of pRN1120 |
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) | Zymo Research | E1006 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme) |
Zymolyase storage buffer | Zymo Research | E1004-B | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme) |
Chemicals of general use | |||
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar | Plate growth of E. coli | ||
2*PY medium | Cultivation of E. coli | ||
Demineralized water | Transformation of S. cerevisiae |
||
ELFO buffer | Electrophoresis | ||
MQ | Multiple steps | ||
Physiological salt solution | Transformation of S. cerevisiae |
||
TE buffer | Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae | ||
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | Cultivation of S. cerevisiae | ||
YEPD (2% glucose) agar | Plate growth of S. cerevisiae |
||
Consumables | |||
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes (50 mL) | |||
Microplate 96 wells | |||
Petri dishes | |||
Pipette tips 0.5 – 10 µL | |||
Pipette tips 10 – 200 µL | |||
Pipette tips 100 – 1000 µL | |||
Shake flasks (500 mL) | |||
Sterile filters | |||
Equipment | |||
Centrifuge (Falcon tubes) | |||
Echo 525 acoustic liquid handler | |||
Incubator | |||
NanoDrop | |||
Set for eletrophoresis | |||
Spectrophotometer | |||
Table centrifuge (Eppendorfs tubes) | |||
Thermocycler | |||
Plasmids | |||
pCSN067 | Addgene | ID 101748 | https://www.addgene.org/ |
pRN1120 | Addgene | ID 101750 | https://www.addgene.org/ |
Strains | |||
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D |
EUROSCARF collection | http://www.euroscarf.de |