Questo protocollo descrive come isolare i cheratinociti cutanei dai modelli murinari, per macchiare con anticorpi con tag metallici e analizzare le cellule colorate per citometria di massa al fine di profilare il modello di espressione delle proteine di interesse nelle diverse fasi del ciclo cellulare.
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Articolo metodologico
Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare e quantificare i cambiamenti dell'espressione proteica in modo dipendente dal ciclo cellulare utilizzando singole cellule isolate dall'epidermide della pelle del topo. Ci sono sette passi importanti: separazione dell'epidermide dal dermide, digestione dell'epidermide, colorazione delle popolazioni di cellule epidermiche con cisplatina, codice a barre campione, colorazione con anticorpi metallici marcati per marcatori del ciclo cellulare e proteine di l'interesse, la rilevazione di anticorpi con etichettatura metallica mediante citometria di massa e l'analisi dell'espressione nelle varie fasi del ciclo cellulare. Il vantaggio di questo approccio rispetto ai metodi istologici è il potenziale per esaminare il modello di espressione di >40 marcatori diversi in una singola cella in diverse fasi del ciclo cellulare. Questo approccio consente anche l'analisi di correlazione multivariata dell'espressione proteica che è più quantificabile rispetto ai metodi istologici/immagini. Lo svantaggio di questo protocollo è che è necessaria una sospensione di singole cellule, che si traduce nella perdita di informazioni sulla posizione fornite dalla colorazione delle sezioni di tessuto. Questo approccio può anche richiedere l'inclusione di marcatori aggiuntivi per identificare diversi tipi di cellule nelle sospensioni cellulari grezze. L'applicazione di questo protocollo è evidente nell'analisi dei modelli di malattia iperplastica della pelle. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per l'analisi di specifici sottotipi di cellule (ad esempio, cellule staminali) mediante l'aggiunta di anticorpi specifici del lignaggio. Questo protocollo può anche essere adattato per l'analisi delle cellule della pelle in altre specie sperimentali.
Introduzione
La correlazione dell'espressione genica con le fasi del ciclo cellulare rimane una sfida nell'analisi di modelli animali di malattie iperplastiche come il cancro. Parte di questa sfida è la coordinazione delle proteine di interesse (POI) con marcatori di proliferazione. Le cellule proliferative possono essere trovate in varie fasi del ciclo cellulare tra cui G1, S, G2 e M. Ki67 è uno dei marcatori più comunemente utilizzati di proliferazione ed è espresso in tutte le fasi del ciclo cellulare. È stato ampiamente utilizzato nell'analisi dei tessuti sia umani che murini1,2,3. Tu....
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Protocollo
Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso del campus medico dell'Università del Colorado ha approvato gli esperimenti sugli animali descritti in questo protocollo.
1. Preparativi
- Progettare un pannello anticorpo con tag metallici. Utilizzare il software di progettazione pannello online gratuito12 e includere 127IododeoxyUridina (IdU), 164Dy (Dysprosium) etichettato anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), e 150 Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA proteinaSer807/811 (pRB)13. Aggiungere ....
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Risultati
La tabella 1 mostra le rese cellulari e la fattibilità previste dall'orecchio adulto del topo (Figura 1) e dalla pelle neoatale in condizioni non patologiche. La tabella mostra anche i dati rappresentativi degli animali provenienti da uno sfondo misto C57/126. Si prevede che la pelle di altri ceppi si tradurrà in rese cellulari e vitalità simili. La resa approssimativa dipende dalla superficie della pelle e indica che la pelle neonale sarebbe.......
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Discussione
Il protocollo descritto in questo documento può essere completato in circa 8 ore. Il risultato finale è una sospensione delle cellule arricchite in PC che possono essere analizzati per l'espressione proteica in modo dipendente dal ciclo cellulare. Diversi studi precedenti hanno delineato metodi per isolare i K dalla pelle umana e del topo16,25. Questi studi includono anche protocolli per l'isolamento dei KC per la citometria di flusso26. T.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il sostegno a questo lavoro è stato fornito dal Dipartimento di Dermatologia, dal Gates Center for Regenerative Medicine presso l'Università del Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212). Gli autori riconoscono la sovvenzione di supporto e risorsa di supporto Cytometry Shared Resource and support (NCI P30 CA046934) per il funzionamento del citometro di massa e sono grati per Karen Helm e Christine Childs al centro per i loro consigli di esperti sul flusso e sulla citometrica di massa Tecniche.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra a 12 pozzetti | Cell Treat | 229512 | |
| Soluzione intercalatrice | Fluidigm | 201192A | 125 &; M - Soluzione intercalatrice Ir |
| Microscopia elettronica | Paraformaldeide | Scienze 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Tappo filtro tubi di flusso | Fisher/Corning | 352235 | 35 &; m dimensione dei pori |
| Setaccio per celle | Fisher | 22363547 | 40 μ m dimensione dei pori |
| Soluzione di distacco cellulare | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | accutasio |
| ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7,5%-iodio scrub chirurgico | |
| Tampone di permeabilizzazione del codice a barre | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Codici a barre | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Strisce pH | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco' s Eagle Media |
| modificato Pinza fine | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Pinza curva di precisione | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Perle di calibrazione | Fluidigm | 201078 | EQ Perle di calibrazione a quattro elementi |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Acqua di grado di biologia molecolare |
| Iododeossiuridina | Sigma | I7125 | IdU |
| Fiale criogeniche | ThermoFisher | 366656PK | filettatura interna |
| Tampone di colorazione cellulare | Fluidigm | 201068 | Maxpar Tampone di colorazione cellulare |
| Fix & tampone permanente | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Tampone permanente |
| Fix I tampone | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I tampone |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Rockland | MB-008 | 10x PBS senza metallo |
| ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty | |
| Idrossido di sodio | Fisher | BP359-500 | |
| Piastra di Petri | NaOH Kord-Valmark | 2900 | Fornito da Genesee 32-107 |
| 15 mL conico | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conico | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| piastra a 6 pozzetti | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatino | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Acido cloridrico | Fisher | A144-212 | |
| Tampone di permeabilizzazione per colorazione con antigene nucleare | Fluidigm | 201063 | |
| Tampone per colorazione con antigene nucleare | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Siringa per tubercolina | BD | 309626 | |
| Collagenasi di tipo IV | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
Riferimenti
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A.
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Ristampe e permessi
