Isolering og farvning af mus hud keratinocytter for celle cyklus specifik analyse af cellulært protein ekspression ved Massecytometri
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man isolerer hudens keratinocytter fra musemodeller, til farvning med metal mærkede antistoffer, og til at analysere farvede celler ved massecytometri for at profilere udtryks mønstret af proteiner af interesse i de forskellige celle cyklus faser.
Abstract
Målet med denne protokol er at detektere og kvantificere ændringer i protein ekspression i en celle cyklus-afhængig måde ved hjælp af enkeltceller isoleret fra epidermis af mus hud. Der er syv vigtige trin: adskillelse af epidermis fra dermis, fordøjelsen af epidermis, farvning af epidermal cellepopulationer med Cisplatin, prøve barkodning, farvning med metal mærkede antistoffer for celle cyklus markører og proteiner af interesse, påvisning af metal mærkede antistoffer ved massecytometri og analyse af ekspression i de forskellige celle cyklus faser. Fordelen ved denne tilgang over histologiske metoder er potentialet til at assay udtryks mønsteret af > 40 forskellige markører i en enkelt celle i forskellige faser af cellecyklussen. Denne fremgangsmåde giver også mulighed for multivariat korrelationsanalyse af protein ekspression, der er mere kvantificerbare end histologiske/billedbehandlings metoder. Ulempen ved denne protokol er, at en suspension af enkeltceller er nødvendig, hvilket resulterer i tab af lokaliseringsoplysninger fra farvning af vævs sektioner. Denne fremgangsmåde kan også kræve medtagelse af yderligere markører for at identificere forskellige celletyper i rå celle suspensioner. Anvendelsen af denne protokol er tydelig i analysen af hyperplastiske hudsygdoms modeller. Desuden kan denne protokol tilpasses til analyse af specifikke undertyper af celler (f. eks. stamceller) ved tilsætning af Lineage specifikke antistoffer. Denne protokol kan også tilpasses til analyse af hudceller i andre forsøgs arter.
Introduction
Korrelation af genekspression med celle cyklus faser er fortsat en udfordring i analysen af dyremodeller af hyperplastiske sygdomme som kræft. En del af denne udfordring er co-påvisning af proteiner af interesse (POI) med markører for spredning. Proliferative celler kan findes i forskellige celle cyklus faser herunder G1, S, G2, og M. Ki67 er en af de mest almindeligt anvendte markører for spredning og udtrykkes i alle faser af cellen cyklus. Det er blevet flittigt anvendt i analysen af både humane og mus væv1,2,3. Men ligesom andre generelle spredning markører, Ki67 ikke skelne individuelle celle cyklus faser. En mere præcis tilgang bruger inkorporering af thymidinnukleotid analogerne som bromodeoxyuridine (brdu) i celler, der aktivt Repliker deres genomet (dvs. S-fase)4,5. En ulempe ved brugen af nukleotidanaloner er behovet for at administrere dem til levende dyr timer før analyse. Ki67 og BrdU er almindeligt detekteret på faste vævs sektioner ved brug af antistoffer. En fordel ved denne fremgangsmåde er, at placeringen af POI’er kan fastslås inden for vævs arkitekturen (f. eks. det basale lag hud epidermis). Denne fremgangsmåde kræver heller ikke vævs dissociation, der kan føre til ændringer i genekspression. En ulempe er, at vævs fiksering eller behandling af vævet til OLT-frosset eller paraffin-skæring kan medføre antistofmål (dvs. antigener). Genfinding af antigener kræver typisk varme-eller vævs fordøjelse. Kvantificering af farvnings intensiteter kan også være udfordrende. Dette skyldes variationer i farvning, snittykkelse, signaldetektering, og eksperimententer bias. Desuden kan et begrænset antal markører detekteres samtidigt i de fleste typiske laboratorie opsætninger. Endnu, nyere multiplex farvning tilgange lover at overvinde disse begrænsninger; Eksempler herpå er billedbehandlings massecytometri og tyramid-signal forstærkning6,7.
Flow cytometri er en anden kraftfuld teknologi til at detektere prolifererende celler. Det giver mulighed for multiplex påvisning af markører i de samme celler, men kræver vævs dissociation for de fleste ikke-hæmatopoietiske celletyper. Analyse af prolifererende celler sker rutinemæssigt ved brug af farvestoffer, der binder DNA (f. eks Propidium iodide (PI))8. Flowcytometri giver også mulighed for en mere præcis bestemmelse af celle cyklus faser, når det kombineres med påvisning af BrdU inkorporering9. Selv om en stærk tilgang, brdu/pi flow flowcytometri har sine ulemper. Det er ikke i stand til at løse de G2/M og G0/G1 faser uden inddragelse af fase-specifikke antistoffer. Antallet af antistoffer, der kan anvendes, er dog begrænset af cellulær autofluorescens, spektral afsmittende virkninger af fluoroforet-emissioner og brug af kompensations kontrol. Denne begrænsning Marcus det mere udfordrende og omstændelig at co-detektere udtrykket af celle cyklus markører med POI’er. En mere facile tilgang er at bruge massecytometri10,11. Denne teknologi bruger metal konjugeret antistoffer, der har en smallere detekterings spektrum. Når cellerne er plettet med metal mærkede antistoffer, er de fordampet, og metallerne detekteres ved flowcytometri Time-of-Flight (cytof) massespektrometri. På grund af disse egenskaber muliggør massecytometri multiplex-detektion af > 40 forskellige markører ved hjælp af eksisterende platforme10,11. Desuden er det muligt at stregkode prøver med metaller, der resulterer i besparelser af dyrebare antistoffer og samtidig reducere prøve-til-prøve farvning variation. På den anden side har masse cytometri flere ulemper. Der er et begrænset antal kommercielt tilgængelige metal mærkede antistoffer for ikke-blod afledte celler. Kvantificering af DNA-indholdet er mindre følsomt sammenlignet med brugen af fluorescerende DNA-farvestoffer, og massecytometri har et reduceret dynamisk spektrum af signaldetektering i forhold til fluorescens flow cytometri.
Den protokol, der er beskrevet her, er designet til at analysere celle cyklus dynamik fra nyligt isolerede keratinocytter (KCs) fra mus hud og karakterisere celle cyklus specifikke protein udtryk i disse celler ved hjælp af massecytometri. Denne protokol kan også bruges med dyrkede celler eller tilpasset andre celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen, der er skitseret i dette dokument, kan udfyldes i ca. 8 timer. Slutresultatet er en suspension af celler beriget i KCs, der kan analyseres for protein ekspression i en celle cyklus-afhængig måde. Flere tidligere undersøgelser har skitseret metoder til at isolere KCS fra menneske og mus hud16,25. Disse undersøgelser omfatter også protokoller for isolering af KCs til strømnings cytometri26. Der er imidlertid ikke tidligere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støtte til dette arbejde kom fra Department of Dermatology, Gates Center for regenerativ medicin på University of Colorado og University of Colorado (UC) hudsygdom Center morfologi og Phenotyping kerner (NIAMS P30 AR057212). Forfatterne anerkender UC Cancer Center flow cytometry Shared Resource og support Grant (NCI P30 CA046934) for driften af Mass flowcytometer og er taknemmelig for Karen Helm og Christine Childs i kernen for deres ekspertrådgivning om flow og masse cytometriske Teknikker.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
Riferimenti
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Ricerca sul cancro. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
