Vi præsenterer her en protokol for differentiering af menneskelige inducerede pluripotente stamceller i hver somite derivat (myotome, sclerotome, dermatome og syndetome) i kemisk definerede betingelser, som har applikationer i fremtidige sygdom modellering og celle-baserede behandlinger i ortopædisk kirurgi.
Som reaktion på signaler såsom WNTs, ben morfogenetiske proteiner (BMP), og sonic hedgehog (SHH) udskilles fra de omkringliggende væv, somites (SMs) give anledning til flere celletyper, herunder myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D) og syndetome (SYN) , som igen udvikler sig til skeletmuskulatur, aksiale skelet, dorsale dermis og aksial senen/ligament, henholdsvis. Generation af SMs og deres derivater fra menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er derfor afgørende at få pluripotente stamceller (PSC) til anvendelse i regenerativ medicin og sygdom forskning inden for ortopædisk kirurgi. Selv om protokollerne induktion til MYO og SCL fra kvikskrankerne har tidligere rapporteret af flere forskere, har ingen undersøgelse endnu vist induktion af SYN og D fra iPSCs. Derfor, effektive induktion af fuldt kompetente SMs fortsat en stor udfordring. Her, sammenfatte vi menneskelige SM mønstre med human iPSCs in vitro-ved at efterligne signaling miljøet under chick/mus SM udvikling, og rapporten om metoder til systematisk induktion af SM derivater (MYO, SCL, D og SYN) fra menneskelige iPSCs under kemisk definerede betingelser gennem presomitic mesoderm (PSM) og SM stater. Viden om chick/mus SM udvikling blev anvendt til induktion af SMs med menneskelige iPSCs. Denne metode kan være en roman værktøj for at studere menneskers somitogenesis og mønster uden brug af embryoner og cellebaseret terapi og sygdom modellering.
Udvikle en styret differentiering metode til en ønskede celletype fra kvikskranker er et nødvendigt skridt for at oversætte studiet af PSC-afledte celler til kliniske anvendelser. Tvungen udtryk for centrale gener er en lovende strategi for orgel-celle differentiering fra PSC’er og har forbedret vores forståelse af den genetiske regulering af celle skæbne beslutsomhed, orgel morfogenese og organisation under embryogenese1. Desuden betragtes recapitulating de endogene signaling miljøer, ved hjælp af udviklingen af mus og chick embryoner som en køreplan, som afgørende for styret differentiering af PSC’er. Da anvendelsen af PSC-afledte celler i kliniske undersøgelser såsom celle-baserede behandlinger, er den sidstnævnte strategi imidlertid mere egnet fordi det ikke kræver genmanipulation.
Flere undersøgelser har rapporteret induktion af mesoderm fra mennesker og mus PSC’er i kemisk definerede betingelser. Typisk, disse metoder har påberåbt sig activin/nodal/omdanne vækst faktor β (TGFβ) signalering og ben morfogenetiske proteiner (BMP) signalering, menes at udføre meso-endoderm og mesoderm differentiering, hvilket resulterer i en lav induktion effektivitet de paraksiale mesoderm (ca 20%)2. Med andre ord, var PSC-afledte mesoderm induceret af disse signaling veje hovedsagelig laterale plade mesoderm og ikke paraksiale mesoderm. For nylig, et par undersøgelser har vist den effektive produktion af PSC-afledte paraksiale mesoderm baseret på forskellige strategier3,4,5,6,7,8 . I disse undersøgelser, kvikskrankerne var kulturperler med relativt høje koncentrationer af glykogen syntase kinase 3 (GSK3)-hæmmere (WNT signaling aktivatorer), derfor induktion effektiviteten af paraksiale mesoderm nået 70% – 95%6,7 .
I somitogenesis, de paraksiale mesoderm først danner presomitic mesoderm (PSM) posteriort, og derefter danner somites (SMs) i den forreste del gennem udkom til epitelial overgang9,10. Notch ligand Delta-lignende 1 (DLL1) er kendt for at have en central rolle under somitogenesis, som vakler kontrol af DLL1 udtryk, begge i mRNA og protein niveau, regulerer SM segmentering. SMs til sidst opdele i to dele, hvilket giver anledning til dermomyotome (DM) dorsalt og sclerotome (SCL) ventrally11. Efterfølgende differentierer DM til dermatome (D), en forløber for den dermis, og myotome (MYO), en forløber for skeletmuskulaturen; Derudover danner en ventrale del af SCL syndetome (SYN), en forløber for sener og ledbånd12 (figur 1). Nogle forskere har rapporteret induktion af PSC-afledte SM derivater som MYO4,13 og SCL14; der er dog flere begrænsninger i disse undersøgelser. Især, da vores viden om de signaling miljøer af D og SYN er fragmentarisk, blevet induktion protokoller for D og SYN endnu ikke systematisk fastsat. For at demonstrere fuld-kompetence af SMs induceret fra PSC’er, er det vigtigt at vise multi differentieringen kapacitet af inducerede SMs til alle fire derivater (D, MYO, SCL og SYN), mens tidligere undersøgelser har kun fokuseret på specifikke SM derivater. Her, rapport vi om hvordan man kan generere alle fire SM derivater, herunder D og SYN, gennem PSM og SM skæbner fra menneskelige iPSCs15. Vi mener, at etablering af en in vitro-trinvis metode at modeller udviklingsprocessen SM kunne bidrage til studiet af hvordan menneskelige SM udvikler under embryogenese, uden brug af embryoner.
En velkendt metode til induktion af PSC-afledte SM gennem PSM er en kombination af CHIR99021 + A83-01 (TGFβ-hæmmer) under PSM induktion fra PSC, men ikke under PSM modning processen6. I den foreliggende undersøgelse, blev WNT/beta-catenin signalering hæmmet ved hjælp af C59 for at fremkalde SM fra PSM. Men vi indførte brugen af CHIR99021 til at aktivere WNT pathway under SM differentiering. Denne beslutning blev foretaget på grundlag af den konstatering, at flere WNTs er udtrykt i det omgivende væv af SM og i betragtning af, at WNT reportere er aktive i SM20. Som et resultat, observeret vi epithelialization, en karakteristisk for SM in vivo, kun under betingelsen med CHIR99021, baseret på akkumulering af CDH11 i celle-celle vejkryds (figur 2E). Denne observation angiver den kritiske inddragelse af WNT signalering under PSM differentiering og SM epithelialization, derfor vores protokol kan bedre sammenfatte den endogene signaling miljø. Det indebærer imidlertid også en yderligere mulighed for at finjustere WNT/beta-catenin signalering pathway under differentiering, fordi robustheden og effektiviteten af differentiering kan variere betydeligt afhængigt af celletyper, cellelinjer og forskellige kemiske forbindelser af WNT-induktorer bruges af hver forsker.
Denne metode også giver os mulighed at generere alle fire SM derivater, MYO, D, SCL og SYN, fra menneskelig iPSCs. Vores trinvis protokoller ved hjælp af CDM kan bruges til at identificere de signaling krav under menneskelige somitogenesis/somite mønster, og give vigtig indsigt i menneskelige SM udvikling. For eksempel, kan vores metoder være nyttigt for at studere segmentering ur mekanismer, en molekylær oscillation system, der regulerer dannelsen af SM. Det er blevet grundigt undersøgt i mus, kyllinger og zebrafisk, men ikke hos mennesker på grund af manglende relevante eksperimentelle værktøjer.
Derudover kan vores metode gælde for fremtidige kliniske celle-baserede behandlinger. For eksempel, menneskelige iPSC-afledte D eller SYN kan transplanteres ind alvorligt skadede huden eller bristede sener til regenerering og behandling. Flere begrænsninger skal dog løses før metoden kan anvendes praktisk. Selv i den nuværende undersøgelse, brugte vi SNL feeder celler til iPSC vedligeholdelse og ECM-løsningen, som er udvundet af Engelbreth-Holm-sværm mus sarkom, som en overflade frakke på fadet under induktion, skal disse ikke-menneskelige dyr-afledte reagenser være fjernet for at forbedre klinisk kvalitet. Derudover skal celle mængde og kvalitet, som omfatter renhed og modningen af de ønskede celler, også forbedres. Ikke kun celle nummer, men også celle styrken er endvidere et vigtigt kendetegn for senen/ligament regenerering. Derudover, udviklingen af overflade markører for rensning og en ny metode til 3D rekonstitution er uundværlig for at fremme vores protokoller til klinisk celle-baserede behandlinger.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Junya Toguchida (CiRA) for hans hjælp med projekt administration og finansiering erhvervelse, Mr. Mitsuaki Shibata (CiRA) og Ms. Mei Terashima (CiRA) for deres tekniske bistand, Dr. Yayoi Toyooka (CiRA) og Dr. Daisuke Kamiya (CiRA) for deres korrekturlæsning af håndskriftet, og Mr. Masaya Todani (CiRA) for at give en illustration (figur 1). Vi takker også alle medlemmerne af Ikeya og Toguchida laboratorier (CiRA) for deres støtte i løbet af denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af Grants-in-aid for videnskabelig forskning fra Japan samfund for at fremme af videnskab (JSP’ER) (26670661), programmet for genstridig sygdomme forskning udnytte sygdoms-specifikke IP’er celler fra Japan videnskab og teknologi Agenturet (JSO) og Japan Agency for medicinalforskning og udvikling (AMED), Core Center for iPS Cell Research Research Center netværk for realisering af regenerativ medicin (JST/AMED) og iPS celle forskningsfond (delvis til Makoto Ikeya og Junya Toguchida). Makoto Ikeya blev også støttet af Grants-in-aid for videnskabelig forskning (JSP’ER) (16H 05447) og den Acceleration Program for genstridig sygdomme forskning udnytte sygdoms-specifikke IP’er celler (AMED).
ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
Cell streching device | Strex | STB-140 | |
Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
CHIR99021 | Axon | 1386 | |
COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
DMEM | Sigma | D6046 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
DMH1 | Tocris | 4126 | |
EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
FGF2 | Wako | 060-04543 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
Insulin | Wako | 090-06474 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Axon | 1509 | |
Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
PBS | – | – | |
PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
SAG | Calbiochem | 566661 | |
SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |