Confocal levande avbildning av skjuta Apical Meristems från olika växtarter
Summary
Detta protokoll presenterar hur live bild och analysera de skjuta apical meristems från olika växtarter med laserscanning konfokalmikroskopi.
Abstract
Den skjuta apical meristem (SAM) fungerar som en reservoar som bevarade stamceller och det genererar nästan alla aboveground vävnader under postembryonic utveckling. Aktivitet och morfologi av SAMs avgöra viktiga agronomiska egenskaper, såsom skjuta arkitektur, storlek och antal reproduktiva organ, och viktigast av allt, korn avkastning. Här, tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att analysera både ytan morfologi och inre cellstruktur levande SAMs från olika arter genom laserscanning confocal mikroskopet. Hela proceduren från provberedningen till förvärvet av högupplösta tredimensionella (3D) bilder kan åstadkommas inom så kort som 20 minuter. Vi visar att detta protokoll är mycket effektiv för att studera inte bara Blomställningen SAMs modell arter men också de vegetativa meristems från olika grödor, ger ett enkelt men kraftfullt verktyg för att studera organisation och utveckling av meristems över olika växtarter.
Introduction
Anläggningen meristemen innehåller en pool av odifferentierade stamceller och kontinuerligt upprätthåller växt orgel tillväxt och utveckling1. Under postembryonic utveckling härrör nästan alla aboveground vävnader av en växt som från den skjuta apical meristemen (SAM). I grödor är aktivitet och storlek av SAM och dess härledda blommig meristems tätt associerade med många agronomiska egenskaper såsom skjuta arkitektur, fruktodling och utsäde avkastning. Till exempel i tomat orsakar en utvidgad SAM en ökning av Skjut och Blomställning förgrening, och därmed resultat generera extra blomma och frukt organ2. I majs leder en ökning av SAM storlek till ett högre utsäde antal och totala avkastningen3,4. I sojabönor, den meristem obestämdhet är också nära associerat med shoot arkitekturen ger och5.
De morfologi och anatomi av SAMs kan kännetecknas av flera olika metoder, inklusive histologiska snittning/färgning och scanning electron microscopy (SEM)6, som båda har mycket avancerade meristem forskningen genom att tillhandahålla antingen avsnittsvy eller tredimensionella (3D) yta över SAMs. Men båda metoderna är tidskrävande, som inbegriper flera experimentella steg från provberedningen till dataförvärvet, och dessa metoder är främst beroende av fasta prover. Senaste framstegen inom laserscanning konfokalmikroskopi teknik har övervunnit dessa begränsningar och ger oss ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellstruktur och utvecklingsprocess växt vävnader och organ7,8. Genom optisk snarare än fysiska vävnad snittning, confocal microscopy tillåter insamling av en serie z-stack bilder och den efterföljande 3D rekonstruktionen av provet genom bild analys programvara.
Här beskriver vi ett effektivt förfarande för att undersöka både inuti och ytstrukturer levande SAMs från olika växtarter med laserscanning konfokalmikroskopi, som potentiellt tillåter forskare att utföra alla de experimentella process inom så kort som 20 minuter. Skiljer sig från andra publicerade metoder för levande confocal avbildning av Arabidopsis Blomställning SAMs9,10,11,12,13,14, 15 och Arabidopsis blommor12,13, här visar vi att detta protokoll är mycket effektiv för att studera inte bara de Blomställning meristems av modell arter men också den vegetativa skott apical meristems från olika grödor, såsom tomat och sojabönor. Denna metod förlitar sig inte på transgena fluorescerande markörer och potentiellt kan användas för att studera de skjuta meristems från många olika arter och sorter. Dessutom introducerar vi också enkel bildbehandling steg för att visa och analysera olika SAMs i en 3D-vy. Sammantaget kommer den här enkla metoden att underlätta forskare bättre förståelse både struktur och utvecklande process för meristems från både modellorganismer och grödor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, vi beskriver en enkel bildgivande metod som kan tillämpas på studiet av skjuta apical meristems från olika växter med mindre modifiering, öppnar en ny väg för att studera meristem förordningen vid både vegetativ och reproduktiva faser i modell växter och grödor. I motsats till den SEM och histologiska färgning metoder, kan detta protokoll hjälpa avslöja både ytan och inre cellulära strukturer av SAMs, utan behov av arbetsintensiva prov fixering och/eller vävnad snittning steg. Detta protokoll är o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Purdue Bindley Bioscience Center Imaging anläggning för att komma åt lasern skanning confocal Mikroskop och tekniskt stöd, och författarna uppskattar hjälpen från Andy Schaber i Purdue Bindley Imaging anläggningen. Denna aktivitet finansierades av Purdue University som en del av AgSEED vägskäl finansiering för att stödja Indianas jordbruk och landsbygdens utveckling.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
Riferimenti
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Biologia dello sviluppo. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
