不同植物种的射击顶端共聚焦活图
Summary
该协议介绍了如何利用激光扫描共聚焦显微镜对不同植物种类的芽顶端分生组织进行成像和分析。
Abstract
芽顶端分生组织 (SAM) 作为一个保守的干细胞库发挥作用, 它在胚胎发育过程中产生几乎所有的地上组织。Sam 的活性和形态决定了重要的农艺性状, 如芽结构、生殖器官的大小和数量, 最重要的是粮食产量。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 用于分析表面形态和内部细胞结构的生活 Sam 从不同的物种通过激光扫描共聚焦显微镜。从样品制备到获取高分辨率三维 (3D) 图像的整个过程可以在短短20分钟内完成。我们证明, 该方案不仅可以很有效地研究模型种的花序 sam, 还可以研究不同作物的营养分生, 为研究模型的组织和发展提供了一个简单而有力的工具。不同植物物种的分生组织。
Introduction
植物分生组织包含一个未分化的干细胞池, 并不断维持植物器官的生长和发育1。在胚胎后发育过程中, 植物的几乎所有地上组织都来源于茎顶端分生组织 (SAM)。在作物中, SAM 及其衍生花卉分型的活性和大小与许多农艺性状密切相关, 如芽结构、果实产量和种子产量。例如, 在番茄中, 扩大的 SAM 会导致芽和花序分枝的增加, 从而产生额外的花和水果器官2。在玉米中, sam 大小的增加导致种子数量和总产量增加3,4。在大豆中, 分生组织的不确定性也与芽的结构和产量密切相关。
Sam 的形态和解剖结构可以用几种不同的方法来表征, 包括组织学切片染色和扫描电镜 (SEM)6, 这两种方法都通过提供了分生组织的研究, 大大推进了分生组织的研究。截面视图或 sam 的三维 (3D) 表面视图。然而, 这两种方法都很耗时, 涉及从样品制备到数据采集的几个实验步骤, 这些方法主要依赖于固定样品。激光扫描共聚焦显微镜技术的最新进展克服了这些局限性, 为我们研究植物组织和器官的细胞结构和发育过程提供了一个强大的工具 7,8。通过光学而不是物理组织切片, 共聚焦显微镜允许收集一系列 z 堆栈图像, 并随后通过图像分析软件对样本进行3D 重建。
在这里, 我们描述了一个有效的程序, 用于利用激光扫描共聚焦显微镜研究不同植物物种的活体 Sam 的内部和表面结构, 这可能使研究人员能够完成所有的实验在短短20分钟内处理。不同于其他已出版的拟南芥花序 sam 9,10,11, 12,13,14的活共聚焦成像方法, 15和拟南芥花12,13, 这里我们证明了这个协议是高效的, 不仅研究了模型物种的花序分生子, 而且植物芽来自不同作物的顶端分生组织, 如西红柿和大豆。该方法不依赖转基因荧光标记, 有可能应用于研究来自许多不同种类和品种的幼苗分生组织。此外, 我们还介绍了在3D 视图中查看和分析不同 sam 的简单图像处理步骤。总之, 这种简单的方法将有助于研究人员更好地了解从模型生物和作物的分生组织的结构和发育过程。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了一种简单的成像方法, 该方法可应用于不同植物的茎尖分生组织的研究, 并进行轻微的修饰, 为研究模型植物植物和生殖阶段的分生组织调控开辟了新的途径。作物。与扫描电镜和组织学染色方法不同, 该协议可以帮助揭示 Sam 的表面视图和内部细胞结构, 而不需要劳动密集型样品固定和组织切片步骤。该协议还与 Sam 中基于荧光的记者的既定成像方法兼容, 有可能提供良好的细胞分辨率, ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢 Purdue Bindley 生物科学中心成像设施访问激光扫描共聚焦显微镜和技术支持, 并感谢 Andy Schaber 在 Purdue Bindley 成像设备中提供的帮助。这项活动由普渡大学资助, 作为 AgSEED 十字路口资金的一部分, 以支持印第安纳州的农业和农村发展。
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
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