Конфокальный живых изображений меристем апикальной стрелять из различных видов растений
Summary
Этот протокол представляет как жить изображения и анализировать меристем апикальной стрелять из различных видов растений с помощью лазера, Сканирующая конфокальная микроскопия.
Abstract
Стрелять апикальной Меристемы (SAM) функции как сохранение стволовых клеток водохранилище и он производит почти все наземные тканей во время постэмбрионального развития. Деятельности и морфология Самс определить важные агрономических признаков, таких как стрелять архитектуры, размер и количество репродуктивных органов и, самое главное, урожайность зерновых. Здесь мы предоставляем подробный протокол для анализа поверхности морфологии и внутреннюю клеточную структуру жизни Самс из различных видов через лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп. Вся процедура от подготовки образца для приобретения трехмерные (3D) изображения с высоким разрешением может быть достигнуто в рамках как коротким 20 минут. Мы показываем, что этот протокол является очень эффективным для изучения не только соцветие Самс видов модели, но и вегетативных меристем из разных культур, обеспечивая простой, но мощный инструмент для изучения, Организации и развития меристем через различных видов растений.
Introduction
Меристемы завод содержит пул недифференцированных стволовых клеток и постоянно поддерживает орган роста растений и разработка1. Во время постэмбрионального развития почти все наземные ткани растения являются производными от стрелять апикальной Меристемы (SAM). В посевах деятельности и размер Сэм и его производных цветочные меристем тесно связано с много агрономических признаков как стрелять архитектуры, производства фруктов и урожайность семян. Например в томате, расширенном Сэм вызывает увеличение стрелять и соцветия ветвления и таким образом приводит к генерации дополнительных цветов и фруктов органов2. В кукурузе увеличение размера Сэм приводит к выше начального числа и общая доходность3,4. В сои неопределенность Меристемы тесно связан также с архитектурой стрелять и выход5.
Морфология и Анатомия Самс можно охарактеризовать несколькими различными методами, включая гистологическое разрезания окрашивание и сканирование электронная микроскопия (SEM)6, оба из которых значительно продвинулись Меристемы исследований путем предоставления разрез или трехмерные (3D) вид поверхности МСОС. Однако оба метода отнимают много времени, с участием нескольких экспериментальных шагах от Пробоподготовка для сбора данных, и эти методы главным образом зависит от фиксированных выборок. Последние достижения в технику конфокальная микроскопия скеннирования лазера преодолеть эти ограничения и предоставить нам с мощным инструментом для расследования клеточная структура и процесс развития растений тканей и органов7,8. Через оптический вместо физической ткани резания, конфокальная микроскопия позволяет коллекции серии z стек изображений и последующих 3D-реконструкции образца через программное обеспечение для анализа изображения.
Здесь мы Опишите эффективной процедуры для расследования оба внутри и поверхности структуры живых Самс из разных видов, с помощью лазерного сканирования конфокальная микроскопия, который потенциально позволяет исследователям для выполнения всех экспериментальных растений процесс в рамках как коротким 20 минут. Отличается от других опубликованных методов для живой конфокальный изображений Arabidopsis соцветий Самс9,10,11,12,13,14, 15 и арабидопсиса цветы12,13, здесь мы продемонстрировать, что этот протокол является очень эффективным для изучения не только соцветие меристем видов модели, но и вегетативных стрелять апикальной меристем из разных культур, таких как помидоры и сои. Этот метод не полагаться на трансгенные флуоресцентные маркеры и потенциально могут быть применены для изучения меристем стрелять из многих различных видов и сортов. Кроме того мы также представить простой обработки шаги для просмотра и анализа различных МСОС в 3D виде изображений. Взятые вместе, этот простой метод будет способствовать исследователей, лучшего понимания структуры и процесс развития меристем от модельных организмов и культур.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем простой метод визуализации, который может быть применен к изучению меристем апикальной стрелять из различных растений с незначительными изменениями, открывая новые возможности для изучения Меристемы регулирование на этапах как растительного, так и репродуктивных мод…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают Пердью Bindley Bioscience центр визуализации объекта, для доступа к лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп и для технической поддержки, и авторы ценят помощь от Энди Schaber в объекте Bindley Imaging Purdue. Эта деятельность финансировалась Университет Пердью в рамках AgSEED перекрестке финансирование для поддержки Индиана сельского хозяйства и развития сельских районов.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
Riferimenti
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Biologia dello sviluppo. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
