Transimmunization (TI)-anordningen eller plattan och relaterade protokoll har utvecklats för att replikera de viktigaste inslagen i extrakorporeal fotokemoterapi (ECP), i en experimentell miljö, vilket möjliggör produktion av fysiologiskt aktiverade, avstämbara dendritiska celler (DCs) för cancer immun terapi.
Extracorporeal fotokemoterapi (ECP) är en allmänt använd cancer immunoterapi för kutan T-cellslymfom (CTCL), operativa i över 350 universitets centra över hela världen. Samtidigt som ECP: s kliniska effekt och exemplariska säkerhets profil har drivit sin utbredda användning, har en klargörande av de bakomliggande mekanismerna varit en utmaning, delvis på grund av avsaknad av ett laboratorium ECP-modell. För att övervinna detta hinder och skapa en enkel, användarvänlig plattform för ECP-forskning, utvecklade vi en avskalad version av den kliniska ECP-leukocytprocessenheten, lämplig för arbete med både mus modeller och små blod prov från människa. Denna enhet kallas Transimmunization (TI) kammare, eller tallrik. I en serie av landmärke experiment, miniatyriserade enheten användes för att producera ett cell vaccin som regelbundet inledde terapeutisk anti-cancer immunitet i flera syngena mus tumör modeller. Genom att ta bort enskilda faktorer från det experimentella systemet och fastställa deras bidrag till in vivo anti-tumör svar, klargjorde vi sedan viktiga mekanistiska förare av ECP immuniseringsämnet potential. Sammantaget visade våra resultat att anti-tumöreffekter av ECP initieras av dendritiska celler (DC), fysiologiskt genereras genom blod monocyter interaktion med trombocyter i TI plattan, och laddad med antigener från tumör celler vars apoptotiska cell döden titreras fint genom exponering för det fotoactivatable DNA-tvär bindnings medlet 8-metoxipsoralen och UVA-ljus (8-MOPa). När återvände till musen, detta cellulära vaccin leder till specifika och överförbara anti-tumör T-cell immunitet. Vi kontrollerade att TI kammaren är också lämplig för mänsklig blod bearbetning, producerar humana DCs helt jämförbar i aktiverings tillstånd och profil till de som härrör från den kliniska ECP kammaren. De protokoll som presenteras här är avsedda för ECP studier i mus och människa, kontrollerad generation av apoptotiska tumör celler med 8-MOPA, och snabb produktion av fysiologiska humana och möss monocythärledda domänkontrollanter för en mängd olika tillämpningar.
Extracorporeal fotokemoterapi (ECP) är en etablerad immun terapi som är allmänt operativ i universitets centra över hela världen. Dess användning har drivits av unik selektivitet, säkerhet och dubbelriktad effekt av ECP-behandling, egenskaper som ECP delar med det fysiologiska immun systemet självt med vilket det verkar partner. ECP är selektivt immuniseringsämnet mot de maligna cellerna i kutan T-cellslymfom (ctcl)1,2, och selektivt tolerizing för riktade antigener i transplantationen, autoimmunitet, och graft-versus-host sjukdom (GVHD) inställningar 3 för att , 4. immunogeniciteten hos ECP framhävs av dess beroende av ett intakt CD8 T-cellfack i ctcl5, medan specificitet återspeglas av ECP: s mycket gynnsamma biverknings profil, utan någon icke-målimmunsuppression vid transplantation eller GvHD-inställningar, och ingen ökad opportunistisk infektions känslighet i CTCL, där icke-patogena T-cellsoner potentiellt kan gå förlorade tillsammans med de maligna T-cellerna.
Med tanke på den kliniska betydelsen av ECP, hoppas att bättre förståelse av dess mekanismer kan utvidga ECP: s terapeutiska räckvidd till ett bredare spektrum av cancer och immunologiska störningar har stimulerat internationellt intresse. Två nationellt sanktionerade workshops, ett nationellt institut för hälsa (NIH) State-of-The-Science symposium6 och ett amerikanskt samhälle för aferes konsensus konferens7, genomfördes och rapporteras, i syfte att påskynda identifiering av de främsta cellulära bidrags givarna till ECP: s anti-cancer och tolerogena effekter.
Trots många publicerade rapporter som försöker ta itu med ECP: s mekanism har två primära hinder hittills hindrat vetenskapliga framsteg. För det första har undersökning av ECP-mekanismerna i experiment laboratoriets inställning begränsats av avsaknaden av miniatyr-ECP-enheter som helt skulle återspegla ECP: s cellulära och in vivo-effekter och vara tillämpliga på djur modeller. För det andra har djupgående laboratorie analyser av ECP-prover i den kliniska miljön begränsats av den begränsade till gången på ECP-bearbetade patient immun celler, som kräver till gång till behandlings centra, och är dessutom föremål för tidpunkten för patientens infusioner och det etiska behovet av kompromisslös uppsättning av patient-reinbrända leukocyter.
För att lösa hindren för utvecklingen av ECP: s forskning har vi föresatt oss att utveckla en miniatyr ECP-apparat som närmast skulle efterlikna de viktigaste delarna av terapin. Standard behandling med ECP innebär passage av patientens leukaferes-berikade leukocyter genom en 1 mm tjock, ultraviolett en ljus (UVA)-transparent, plast platta6,8. I plattan, är leukocyter utsätts för 8-metoxipsoralen (8-MOP), en foto-activatable agent som vid UVA-exponering är transitivt omvandlas till en reaktiv form (8-MOPa), kan DNA tvär bindning via dess bivalenta bindning till pyrimidinbaser på syster DNA Strands9,10. Bearbetade, 8-MOPA-behandlade leukocyter samlas in och returneras intravenöst till patienten.
Eftersom ECP själv är en dubbelriktad terapi, immuniseringsämnet i cancer och tolerizing i transplantation, autoimmunitet och GVHD inställningar, för tydligande vi har namngett modell ECP immuniseringsläge “transimmunization”, och tolerogena läge “transtolerization”. Vi fokuserade först på transimmunization modalitet. Vår nyligen rapporterade miniatyriserade skalbara mus-till-man ECP-enhet, transimmunization (TI) kammaren eller plattan, och motsvarande protokoll, reproducera både cellulära och in vivo effekterna av Human ECP enheten i en cancer inställning11.
För att göra transimmuniseringen in vivo-modellen så kliniskt relevant som möjligt, initierade vi immun terapi efter subkutant injicerade syngena mus tumörer blev påtaglig, vilket testar protokollets effektivitet i etablerad cancer. På samma sätt som ECP i CTCL, den Proof-of-princip transimmunization protokoll i YUMM 1,7 modell av melanom använder perifera blod mononukleära celler (PBMC) från tumör-bärande djur. Cellerna leds genom TI-plattan under flöde. Medan 8-MOPen behandling av celler i miniatyr kammaren är möjligt, är det bättre att utföra det separat, för att säkerställa att endast den önskade cell typen utsätts för 8-MOPA. Tidigare studier visar att ECP: s tolerogena effekt medieras av 8-MOPa-skadade antigen-presenterande celler12, medan immuniserande effekten kräver 8-MOPen skada av mål tumör celler11. I transimmuniseringsprotokollet kan antingen tumör cellerna, eller immun cellerna, selektivt exponeras för 8-MOPA vid behov. Eftersom maximera tiden för kontakt mellan 8-MOPA-skadade tumör celler och ECP-inducerad dendritiska celler (DC) har visat sig signifikant förbättra den immunterapeutiska kapaciteten hos kliniska ECP13, införlivade vi en över natten inkuberingsteg i vårt protokoll. Efter nattens inkubation återförs de behandlade cellerna till det tumör bär ande djuret.
Detta system minskade tillförlitligt tumör tillväxt och initierade specifika anti-tumör immunitet hos möss med etablerade syngena tumörer11, och tillät oss att dissekera mekanismen för ECP: s kliniska anti-tumör effekt. I flera studier har vi visat att ECP immunitet initieras genom ex vivo trombocyt aktivering i ti-plattan14,15. Aktiverade trombocyter signalerar därefter den monocyter-till-dendritiska cellmognaden14, vilket leder till produktion av fysiologisk DCS. De nybildade monocyter-härledda DCs kan cross-present internaliserade antigener från 8-MOPA-skadade tumör celler för att aktivera antigen-specifika T cell svar16. Som föreslagits tidigare12,17, dock 8-MOPA-inducerad skada av de begynnande DCS själva kan kontra-Act eller ens vända anti-tumör effekt11, vilket ger en mekanistisk länk till ECP tolerans.
TI-plattan har också använts för att producera fysiologiskt aktiverade domänkontrollanter från mänsklig PBMC. På samma sätt som mus studierna är humana TI-härledda domänkontrollanter beroende av plattpassage i närvaro av blodplättar för sin generation, förefaller fenotypisk identisk med dessa produceras i den kliniska ECP plattan, och kan effektivt bearbeta och Cross-presenterande humana tumör antigener för aktivering av humana T-celler11,16.
Genom att avslöja mekanismen för ECP-immunoterapi har vi därför avslöjat en metod för att snabbt generera fysiologisk mus och humana dendritiska celler av önskad antigen-specificitet, som kan vara funktionellt modulerade. Den innovativa ti-enheten och protokollet har stor potentiell betydelse inom områdena för ECP: s forskning och terapi och cancer immunoterapi mer allmänt, och på alla andra områden med intresse för fysiologiska, funktionella dendritiska celler i antingen immuniseringsämnet eller den tolerizing modaliteten. Vi hoppas att denna publikation kommer att ge de verktyg som behövs till dem som har intresse av sådana forsknings områden.
Miniatyriserad enhet och protokoll som beskrivs ovan för första gången möjliggör en effektiv laboratorie undersökning av mekanismerna för ECP i mus experimentella system, och i små humana blod prov. Detta är ett stort framsteg; till exempel tillät det oss att visa för första gången effekten av transimmunization mot solida tumörer i en mus modell 11, öppna den framtida möjligheten av en liknande tillämpning i mänsklig onkologi.
Innan utvecklingen av transimmuniseringsenheten och metoden som beskrivs här, var det omöjligt att fullt ut undersöka alla aspekter av ECP. I mus modeller, även om 8-MOPen aspekt av terapin kunde replikeras något genom att behandla celler i en petriskål12,20, det fanns ingen förmåga att integrera i metoden plattan passage, som har visat sig dynamiska trombocyt interaktioner som är kritiskt viktiga för ECP: s fysiologiska DC-aktivering14. I mänskliga studier, alternativt, flödet komponenten var fullt närvarande, men möjligheten att selektivt exponera specifika cellulära komponenter till 8-MOPA, eller för att skydda dem från det, saknades21,22. Detta hindrade fullständig förståelse av ECP mekanism, och dess optimering för immunitet eller tolerans. Dessutom är den mängd blod som krävs för att arbeta med den kliniska ECP-apparaten stor och hämmar den vetenskapliga utredningen. Den miniatyriserade ECP-enheten och det protokoll som beskrivs här för första gången möjliggör effektiv, helt flexibel och avstämbara ECP-modellering för laboratorier. Dessutom möjliggör TI-plattan real tids visualisering och övervakning av cellinteraktioner inom plattan genom mikroskopi.
För protokollets framgång med både in vivo-och ex vivo-system är det viktigt att den behandlade PBMC innehåller monocyter som kan aktive ras i funktionella domänkontrollanter. För att denna aktivering ska fortsätta, är det också nödvändigt att se till att PBMC-fraktionen innehåller ett fysiologisk antal friska, activatable blodplättar, och att TI plattan passage protokollet följs noggrant. För att styra de nyligen aktiverade DCs mot en specifik reaktivitet måste de förses med antigen. Vi har funnit att den mest effektiva metoden för antigen leverans för anti-cancer immunitet är övernattning co-inkubation av de nyligen aktiverade DCs med antigen-innehåll ande 8-MOPA-exponerade tumör celler. Detta har den extra fördelen att kunna skapa en immunogent anti-cancer svar utan nödvändiggör tidigare kunskaper om tumörantigener, genom att låta DCs att välja dem. Men i fall där antigenet är känt, vi hade viss framgång i ex vivo-system när du använder fria peptider som antigener i Co-inkubation. För immunogena tillämpningar bör DCs själva skyddas från 8-MOPA Exposure. Slutligen, i in vivo experiment, det är viktigt att arbeta med en djur modell som är kapabel till anti-tumör immunitet. Transimmunization fungerar genom att skapa aktiverade, antigen-specifika DCS, som arbetar i kroppen för att initiera medfödda och adaptiva immun svar. Nedsatt aktivitet eller brist på NK, CD4, eller CD8 T celler i den behandlade musen kommer att påverka protokollets effekt5,11.
Även om protokollet som beskrivs här är ett Proof-of-princip en som har optimerats för en mus solid syngena tumör modell, avslöjar det ändå många möjligheter. Mekanismerna för ECP i onkologi är bara klarlagd, och det finns fortfarande mycket utrymme för bättre förståelse. Mer allmänt, förmågan att generera fysiologiskt aktive rad mus och mänskliga domänkontrollanter, och att selektivt rikta dem mot antigen-specifik immunitet har många potentiella tillämpningar bortom cancer. Förmågan att göra samma sak, men istället styra DCs mot antigen-specifik tolerans, som föreslås av tolerizing effekt av ECP själv, har också omfattande medicinska konsekvenser. Med denna metod hoppas vi kunna tillhandahålla verktyg och öppna en produktiv aveny för forskning för alla med ett intresse för fysiologisk DC terapier.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-NCI Spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); Support för NIH Cancer Center Grant 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); Howard Hughes Medical Institute utbildnings gemenskap (A. Vassall); och NY hjärt stiftelse (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Partiellt stöd tillhandahölls av r01 CA196660-01 till M. Bosenberg.
Författarna är tacksamma för Dr Robert Tigelaar för hans mentors Kap, vägledning och experimentell insikt. Vi tackar våra kollegor på Fraunhofer IBMT, särskilt Dr Thorsten Knoll, för att utveckla och tillhandahålla ECP-motsvarigheten TI-kammaren. Nicholas Theodosakis hjälpte vänligt med inledande stadier av YUMM experiment. Vi tackar våra frivilliga blod givare, Inger Christensen och hennes professionella personal på Yale ECP Treatment Center för hjälp med frivillig blod upphandling. Dr Wendell Yarbrough och Dr Natalia Issaeva vänligt delade med oss SCC61 och SCC61-E6/7 cellinjer. För tekniskt stöd på projektet, tackar vi Dr Julia Lewis för FACS protokoll råd, och E. menet, G. Tokmoulina, C. Cote på Yale FACS core. Film bilder av celler inom TI plattan förvärvades med hjälp av Felix Rivera-Molina, PhD, Institutionen för cell bio logi och Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine. Film produktionen övervakades av Andrew Osborne, Senior Video Producer, kommunikations byrån, Yale School of Medicine.
8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) | Therakos, Inc | Rx only, NDC No. 64067-0216-01 | Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells |
AB serum | Lonza BioWhittaker | 14-498E | Protocol step 8.5 – overnight culture of human PBMC |
ACK red cell lysis buffer | Lonza BioWhittaker | 10-548E | Protocol step 2 – mouse PBMC preparation |
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging | VetEquip | 901820 | Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration |
Autologous mouse plasma | prepare in lab | n/a | Prepare per protocol step 2.4, use in 7.1 – mouse TI treatment administration |
Autologous mouse serum | prepare in lab | n/a | Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 – overnight culture of mouse PBMC |
C57Bl/6J mice | Jackson labs | 0000664 | Protocol steps 1, 2, 5 and 7 – mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return |
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um | Medipoint | 9891620 | Protocol step 2 – mouse PBMC preparation |
Clear RPMI | Gibco by LifeTech | 11835-030 | Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC |
DMEM/F12 | Gibco by LifeTech | 11330-032 | Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture |
EasyGrip Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351008 | Protocol steps 5 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC |
Eppendorf 1.5mL conical tubes | DOT scientific | 1700-GMT | Protocol steps 1-8 |
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) | SAFC Biosciences | 12306C-500mL | Protocol steps 1-4 – YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate |
Hemavet 950FS hematology counter | Drew Scientific | HV950FS | Protocol step 8.2 – monitoring human platelet numbers |
Heparin 5,000U/mL | McKesson Packaging services | 949512 | Protocol steps 2 and 8 – mouse and human PBMC preparation |
Isoflurane | Abbott Laboratories | 5260-04-05 | Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration |
Lympholyte M lymphocyte isolation medium | Cedarlane Labs | CL5035 | Protocol step 2 – mouse PBMC preparation |
Non-essential amino acids | Gibco by LifeTech | 11140-050 | Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture |
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) | Gibco by LifeTech | 14190-144 | Protocol steps 1-7 |
Pen/strep | Gibco by LifeTech | 15140-122 | Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture |
Polypropylene 15mL conical tubes | Falcon | 352097 | Protocol steps 1-8 |
Programmable 2-channel syringe pump | New Era Pump Systems Inc | model NE-4000 | Protocol steps 4 and 8 – running the TI plate |
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 | BD Biosciences | 305109 | Protocol step 7 – mouse TI treatment administration |
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) | BD Biosciences | 309604 | Protocol steps 4, 8 – running the TI plate |
Syringes, 1mL (Slip tip) | BD Biosciences | 309659 | Protocol steps 1, 4, 7, 8 |
TI plate and tubing set | Transimmune AG | not commercially available | Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis. |
TI plate running platform | Transimmune AG | not commercially available | Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis. |
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) | Falcon | 353136 | Protocol steps 1, 2, 6 and 8 – mouse and human cell culture |
Tissue culture plates, 12-well | Falcon | 353043 | Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells |
Tissue culture scrapers | Falcon | 353085 | Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC |
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) | Gibco by LifeTech | 25200-056 | Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture |
Tumor injection needles, 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Protocol step 1 – mouse subcutaneous tumor introduction |
UVA irradiator | Johnson and Johnson | not commercially available | The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us. |
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System | Invitrogen | fluorescence imaging instrument |