L'immunoprecipitazioni della chromatina (ChIP) è un potente strumento per comprendere i meccanismi molecolari della regolazione genica. Tuttavia, il metodo comporta difficoltà nell'ottenere la frammentazione della cromatina riproducibile mediante tosatura meccanica. Qui, forniamo un protocollo migliorato per un saggio ChIP utilizzando la digestione ezimatica.
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Articolo metodologico
Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per esprimere i fenotipi cellulari negli organismi, le cellule viventi eseguono l'espressione genica di conseguenza e i programmi trascrizionali svolgono un ruolo centrale nell'espressione genica. Il macchinario trascrittorio cellulare e le sue proteine di modificazione della cromatina si coordinano per regolare la trascrizione. Per analizzare la regolazione trascrizionale a livello molecolare, sono disponibili diversi metodi sperimentali come lo spostamento della mobilità elettroforetica, i saggi di immunoprecipitazioni transitori e cromatina (ChIP). Descriviamo un saggio ChIP modificato in dettaglio in questo articolo a causa dei suoi vantaggi nel mostrare direttamente le modifiche degli istoni e le interazioni tra proteine e DNA nelle cellule. Uno dei passi chiave di un saggio ChIP di successo è la tosatura della cromatina. Anche se la sonicazione è comunemente usata per la tosatura della cromatina, è difficile identificare le condizioni riproducibili. Invece di tosare la cromatina mediante sonicazione, abbiamo utilizzato la digestione enzimatica con nucleasi micrococcica (MNase) per ottenere risultati più riproducibili. In questo articolo viene fornito un semplice protocollo ChIP assay usando MNase.
Introduzione
L'espressione genica nelle cellule dei mammiferi è regolata in modo stretto e dinamico, e la trascrizione è uno dei passi chiave. La trascrizione genica è regolata principalmente da fattori di trascrizione e istoni. Un fattore di trascrizione è una proteina che si lega a specifiche sequenze di DNA e controlla la trascrizione genica. Questi fattori promuovono o inibiscono il reclutamento di RNA polimerasi II (PolII), che avvia la sintesi di mRNA dal DNA genomico come modello1. Le modifiche istonicome l'acetilazione e la metilazione dei residui della coda istone irto influenzano positivamente e negativamente la trascrizione genica cambiando la st....
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
- Soluzione di paraformaldeide (PFA) del 18,5%. Aggiungere 0,925 g di PFA, 4,8 mL di acqua (utilizzare acqua ultrapurificata per tutto il protocollo) e 35 L da 1 M KOH in un tubo di plastica conica da 50 mL. Chiudere il tappo e riscaldare il tubo in un becher di vetro da 400-600 mL contenente circa 200 mL di acqua utilizzando un forno a microonde. Rimuovere il tubo prima che l'acqua inizi a bollire e vortice il tubo per sciogliere PFA. Lasciare raffreddare la PFA a temperatura ambiente e conservarlo sul ghiaccio.
NOT: Ripetere il riscaldamento e la miscelazione fino a quando il PFA non si scioglie completamente. ....
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Risultati
La digestione della cromatina è uno dei passaggi importanti per un saggio ChIP. Abbiamo usato MNase per digerire la cromatina per ottenere una miscela di oligomeri nucleosomi. Nella fase di digestione di MNase, MNase può passare attraverso la membrana nucleare e digerire la cromatina. Tuttavia, la cromatina digerita non può passare attraverso la membrana e rimane nei nuclei. Per liberare la cromatina digerita dai nuclei, è necessaria una breve sonicazione. Figura 1A mostra microfotografie pr.......
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Discussione
Anche se la sonicazione è comunemente usata per ottenere la cromatina frammentata, è dispendioso in termini di tempo e ingombrante identificare le condizioni riproducibili. In questo protocollo, abbiamo usato la digestione di MNase perché la digestione degli enzimi dovrebbe essere più facile identificare le condizioni riproducibili. Un breve passo di sonicazione dopo la digestione di MNase (vedi passo 2.2) è stato necessario per rompere la membrana cellulare e rilasciare la cromatina digerita. Pertanto, la potenza di son.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è supportata dalle royalties Genentech per City of Hope. Questo lavoro non è supportato in tutto o in parte dai National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2x iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp Scala DNA | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarosio | Prodotto di ricerca Internazionale | A20090 | |
| Ottilfenossi poli(etileneossi)etanolo ramificato | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| Perle magnetiche di proteina G di grado ChIP | Tecnologia di segnalazione cellulare | 9006S | |
| Tampone di diluizione per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) | Millipore Sigma | 20-153 | Composizione del tampone: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM di NaCl. |
| Gel Caricamento Colorante Viola (6x) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glicina | Bio-Rad | 161-0724 | Grado di elettroferesi |
| Glicogeno | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi Halt, senza EDTA (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| Tampone di lavaggio del complesso immunitario ad alto contenuto di sale | Millipore Sigma | 20-155 | Composizione del tampone: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl. |
| Anticorpo istone H3K4me3 (pAb) | Motivo attivo | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Composizione del tampone: 0,25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% acido desossicolico (sale sodico), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1. |
| Tampone di lavaggio del complesso immunitario a basso contenuto di sale | Millipore Sigma | 20-154 | Composizione del tampone: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 pozzetti) | Millipore Sigma | 20-400 | Qualsiasi tipo di supporto per la separazione magnetica compatibile con una provetta da 1,5 mL va bene. |
| Nucleasi micrococcica | New England Biolabs | M0247S | viene fornito con tampone 10x (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,9 a 25 ° C) e 100x BSA (10 mg/mL) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| IgG di coniglio normale | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinasi K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Sistema di PCR in tempo reale | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD anticorpo fosfo Ser5 | Motivo attivo | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | di grado elettroferesi |
| Millipore Sigma | S5636 | ||
| Sonicatore dotato di una sonda a micropunta | QSONICA | Q700 | Qualsiasi tipo di sonicatore compatibile con una provetta da 1,5 mL va bene. |
| Fenolo ultrapuro:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
Riferimenti
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalen....
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Ristampe e permessi
