एकल अणु ट्रैकिंग माइक्रोस्कोपी - Cytosolic अणु के विविध राज्यों का निर्धारण करने के लिए एक उपकरण
Summary
3 डी एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी जीवित जीवाणु कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन के स्थानिक पदों और गति tractories की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रयोगात्मक और डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित पूल एकल अणु tracectories के आधार पर साइटोसोलिक प्रोटीन के प्रचलित diffusive व्यवहार निर्धारित करता है.
Abstract
एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी नैनोमीटर स्थानिक और मिलीसेकंड अस्थायी संकल्प के दसियों के साथ जीवित कोशिकाओं में अलग-अलग अणुओं की स्थिति और गति की जांच करता है। इन क्षमताओं एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी आदर्श शारीरिक रूप से प्रासंगिक वातावरण में आणविक स्तर जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त बनाते हैं। यहाँ, हम दोनों अधिग्रहण और प्रसंस्करण के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल का प्रदर्शन / यह जानकारी जीवित कोशिकाओं में आणविक जटिल गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम एक कैमरा आधारित 3 डी एकल अणु स्थानीयकरण प्रयोग का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं, साथ ही बाद के डेटा प्रसंस्करण कदम है कि व्यक्तिगत अणुओं के tracectories उपज. इन tracectories तो एक संख्यात्मक विश्लेषण ढांचे का उपयोग कर फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं और इन राज्यों के रिश्तेदार बहुतायत के प्रचलित diffusive राज्यों को निकालने का विश्लेषण कर रहे हैं. विश्लेषण ढांचा इंट्रासेल्यूलर ब्राउनियन प्रसार त्रासदियों के स्टोचैस्टिक सिमुलेशन पर आधारित है जो एक मनमाना सेल ज्यामिति द्वारा स्थानिक रूप से सीमित हैं। नकली tracectories के आधार पर, कच्चे एकल अणु छवियों उत्पन्न कर रहे हैं और प्रयोगात्मक छवियों के रूप में एक ही रास्ते में विश्लेषण किया. इस तरह, प्रयोगात्मक परिशुद्धता और सटीकता सीमाएं, जो प्रयोगात्मक जांचना मुश्किल है, स्पष्ट रूप से विश्लेषण कार्यप्रवाह में शामिल हैं। प्रचलित विधुर ीय राज्यों के प्रसार गुणांक और सापेक्ष जनसंख्या भिन्नों का निर्धारण नकली वितरणों के रैखिक संयोजनों का उपयोग करके प्रयोगात्मक मानों के वितरण को उपयुक्त करके किया जाता है। हम एक प्रोटीन है कि एक जीवाणु रोगज़नक़ के cytosol में होमो और विषम-ओलिगोमेरिक परिसरों के गठन पर विभिन्न diffusive राज्यों को दर्शाती है की diffusive राज्यों को हल करके हमारे प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शन.
Introduction
जैव अणुओं के विच्छेत व्यवहार की जांच करने से उनके जैविक कार्यों में अंतर्दृष्टि प्राप्त होती है। फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित तकनीक अपने मूल कोशिका वातावरण में जैव अणुओं को देखने के लिए मूल्यवान उपकरण बन गए हैं। photobleaching के बाद फ्लोरोसेंट वसूली (FRAP) और फ्लोरोसेंट सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस)1 पहनावा औसत diffusive व्यवहार प्रदान करते हैं. इसके विपरीत, एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प 2 ,3,4के साथ व्यक्तिगत फ्लोरोसेंटटैग अणुओं के अवलोकनमेंसक्षम बनाता है। व्यक्तिगत अणुओं को अवलोकन लाभप्रद है क्योंकि ब्याज की एक प्रोटीन विभिन्न विसरणीय राज्यों में मौजूद हो सकता है. उदाहरण के लिए, दो आसानी से भेद करने योग्य diffusive राज्यों उठता है जब एक प्रतिलिपि नियामक, जैसे Escherichia कोलाईमें CueR के रूप में, cytosol में स्वतंत्र रूप से diffuses या एक डीएनए अनुक्रम के लिए बांधता है और माप के timescale पर स्थिर हो जाता है5 . एकल अणु ट्रैकिंग इन विभिन्न राज्यों को सीधे देखने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है, और परिष्कृत विश्लेषण उन्हें हल करने के लिए आवश्यक नहीं हैं. हालांकि, कई विसारक राज्यों और उनकी जनसंख्या के भिन्नों को उन मामलों में हल करना अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है जहां उनकी विसरणदर दरें अधिक समान होती हैं। उदाहरण के लिए, विसरण गुणांक की आकार निर्भरता के कारण, प्रोटीन के विभिन्न अल्पीकरण अवस्थाएँ स्वयं को विभिन्न विसारक अवस्थाओं के रूप में प्रकट करती हैं6,7,8,9 , 10.ऐसे मामलों में डेटा अधिग्रहण, प्रसंस्करण और विश्लेषण के संदर्भ में एक एकीकृत दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।
कोशिकाकोशिका अणुओं की विरूपक दरों को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक कोशिका सीमा द्वारा परिरोध का प्रभाव है। जीवाणु कोशिका सीमा द्वारा आण्विक गति पर लगाए गए प्रतिबंधों के कारण एक साइटोसोलिक अणुओं की मापित विसरण दर धीमी दिखाई देती है यदि एक ही गति एक अप्रतिबंधित स्थान में हुई थी। बहुत धीरे धीरे diffusing अणुओं के लिए, सेलुलर कारावास का प्रभाव सीमा के साथ टकराव की कमी के कारण नगण्य है. ऐसे मामलों में, ब्राउनियन गति के समीकरणों के आधार पर विश्लेषणात्मक मॉडलों का उपयोग करके आणविक विस्थापन, त,या स्पष्ट विसरण गुणांक, डी *के वितरण को सही ढंग से हल करना संभव हो सकता है ( यादृच्छिक विसरण)11,12,13. हालांकि, तेजी से diffusing cytosolic अणुओं के लिए, प्रयोगात्मक वितरण अब कोशिका सीमाओं के साथ diffusing अणुओं की टक्कर के कारण unconfined ब्राउनियन गति के लिए प्राप्त उन लोगों के समान. Confinement प्रभाव सही फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं के unconfined प्रसार गुणांक निर्धारित करने के लिए जिम्मेदार होना चाहिए. कई दृष्टिकोण हाल ही में कारावास प्रभाव या तो (अर्द्ध)) विश्लेषणात्मक 5, 14,15,16 या संख्यात्मक मोंटे कार्लो सिमुलेशन के माध्यम से खाते में विकसित किया गया है ब्राउनियन विसरण6,10,16,17,18,19.
यहाँ, हम एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी डेटा को एकत्रित करने और विश्लेषण करने के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसमें एकल-अणु ट्रैकिंग पर विशेष ध्यान दिया जाता है। प्रोटोकॉल के अंतिम लक्ष्य के अंदर फ्लोरोसेंट लेबल cytosolic प्रोटीन के diffusive राज्यों को हल करने के लिए है, इस मामले में, रॉड के आकार का जीवाणु कोशिकाओं. हमारा काम एकल अणु ट्रैकिंग के लिए पिछले प्रोटोकॉल पर बनाता है, जिसमें एक डीएनए पॉलिमरेज, पोली, प्रसार विश्लेषण20द्वारा डीएनए बाध्य और असीम राज्य में मौजूद दिखाई दिया गया था। यहाँ, हम 3 डी माप करने के लिए एकल अणु ट्रैकिंग विश्लेषण का विस्तार और अधिक यथार्थवादी गणना सिमुलेशन करने के लिए हल करने और कई diffusive राज्यों एक साथ कोशिकाओं में मौजूद मात्रा. डेटा एक घर में निर्मित 3 डी सुपर संकल्प फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप जो डबल हेलिक्स बिंदु-स्प्रेड-फ़ंक्शन (DHPSF)21,22के साथ इमेजिंग द्वारा फ्लोरोसेंट emitters के 3 डी स्थिति का निर्धारण करने में सक्षम है का उपयोग कर हासिल कर लिया है। कच्चे एकल अणु छवियों कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3 डी एकल अणु स्थानीयकरण, जो तब एकल अणु tracectories में संयुक्त कर रहे हैं निकालने के लिए संसाधित कर रहे हैं. हजारों ट्रैजिकरी को स्पष्ट विसरण गुणांकों के वितरण के लिए एकत्रित किया जाता है। एक अंतिम चरण में, प्रयोगात्मक वितरण एक सीमित मात्रा में ब्राउनियन गति के मोंटे-कार्लो सिमुलेशन के माध्यम से प्राप्त संख्यात्मक रूप से उत्पन्न वितरण के साथ फिट हैं। हम इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए प्रकार 3 स्राव प्रणाली प्रोटीन YscQ के diffusive राज्यों को हल करने के लिए रहने वाले Yersinia enterocoliticaमें . इसकी मॉड्यूलर प्रकृति के कारण, हमारा प्रोटोकॉल आमतौर पर किसी भी प्रकार के एकल-अणु या एकल-कण ट्रैकिंग प्रयोग पर लागू होता है जो मनमाने सेल जियोमेटरी में होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल के सफल अनुप्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण कारक यह सुनिश्चित करना है कि एकल अणु संकेत एक दूसरे से अच्छी तरह से अलग हैं (यानी, वे अंतरिक्ष में और समय में विरल होने की जरूरत है (अनुपूरक Mov. 1</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Alecia Achimovich और टिंग यान धन्यवाद. हम एड हॉल, वर्जीनिया विश्वविद्यालय में उन्नत अनुसंधान कम्प्यूटिंग सेवा समूह में वरिष्ठ स्टाफ वैज्ञानिक धन्यवाद, इस काम में इस्तेमाल अनुकूलन दिनचर्या की स्थापना के साथ मदद के लिए. इस काम के लिए धन वर्जीनिया विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| 2,6-diaminopimelic acid | Chem Impex International | 5411 | Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used. |
| 4f lenses | Thorlabs | AC508-080-A | f = 80mm, 2" |
| 514 nm laser | Coherent | Genesis MX514 MTM | Use for fluorescence excitation |
| agarose | Inivtrogen | 16520100 | Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope. |
| ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | M2G ingredient. |
| bandpass filter | Chroma | ET510/bp | Excitation pathway. |
| Brain Heart Infusion | Sigma Aldrich | 53286 | Growth media for Y. enterocolitica. |
| calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | M2G ingredient. |
| camera | Imaging Source | DMK 23UP031 | Camera for phase contrast imaging. |
| dielectric phase mask | Double Helix, LLC | N/A | Produces DHPSF signal. |
| disodium phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | M2G ingredient. |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | S311-100 | Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS. |
| flip mirror | Newport | 8892-K | Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways. |
| fluospheres | Invitrogen | F8792 | Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter. |
| glass cover slip | VWR | 16004-302 | #1.5, 22mmx22mm |
| glucose | Chem Impex International | 811 | M2G ingredient. |
| immersion oil | Olympus | Z-81025 | Placed on objective lens. |
| iron(II) sulfate | Sigma Aldrich | F0518 | M2G ingredient. |
| long pass filter | Semrock | LP02-514RU-25 | Emission pathway. |
| magnesium sulfate | Fisher Scientific | S25414A | M2G ingredient. |
| microscope platform | Mad City Labs | custom | Platform for inverted microscope. |
| nalidixic acid | Sigma Aldrich | N4382 | Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid. |
| objective lens | Olympus | 1-U2B991 | 60X, 1.4 NA |
| Ozone cleaner | Novascan | PSD-UV4 | Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips. |
| potassium phosphate | Sigma Aldrich | 795488 | M2G ingredient. |
| Red LED | Thorlabs | M625L3 | Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm. |
| sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA-Flash 4.0 V2 | Camera for fluorescence imaging. |
| short pass filter | Chroma | ET700SP-2P8 | Emission pathway. |
| Tube lens | Thorlabs | AC508-180-A | f=180 mm, 2" |
| Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd | N/A | N/A | Strain AD4442, eYFP-YscQ |
| zero-order quarter-wave plate | Thorlabs | WPQ05M-514 | Excitation pathway. |
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