JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biochimica

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Published: September 05, 2019
doi:
10.3791/59387
,
1Department of Chemistry,University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics,University of Virginia School of Medicine

Summary

3D enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi udnyttes til at sonde de rumlige positioner og bevægelses forløbskurver af fluorescently mærkede proteiner i levende bakterieceller. Den forsøgs-og dataanalyse protokol, der er beskrevet heri, afgør den udbredte åbne systemer opførsel af cytosolisk proteiner baseret på poolede enkelt molekyle forløbskurver.

Abstract

Enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi soner positionen og bevægelserne af individuelle molekyler i levende celler med snesevis af nanometer rumlige og millisekund temporale opløsning. Disse kapaciteter gør enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi ideelt egnet til at studere molekylært niveau biologiske funktioner i fysiologisk relevante miljøer. Her viser vi en integreret protokol for både erhvervelse og behandling/analyse af Single-molekyle tracking data til at udtrække de forskellige difpulsive stater et protein af interesse kan udstille. Disse oplysninger kan bruges til at kvantificere molekyle kompleksdannelse i levende celler. Vi leverer en detaljeret beskrivelse af et Kamerabaseret 3D-lokaliserings eksperiment med et enkelt molekyle samt de efterfølgende databehandlings trin, der giver de enkelte molekyler forløbskurver. Disse forløbskurver analyseres derefter ved hjælp af en numerisk analyseramme til at udtrække de fremherskende åbne systemer tilstande af fluorescently mærkede molekyler og den relative overflod af disse stater. Analyse strukturen er baseret på stokastiske simuleringer af intracellulære brownian diffusion-forløbskurver, der er rumligt afgrænset af en vilkårlig celle geometri. Baseret på de simulerede forløbskurver genereres og analyseres rå single-molekyle billeder på samme måde som eksperimentelle billeder. På denne måde er eksperimentelle præcisions-og nøjagtigheds begrænsninger, som er svære at kalibrere eksperimentelt, eksplicit indarbejdet i analyse arbejdsgangen. Diffusions koefficienten og den relative populations fraktion af de fremherskende åbne systemer tilstande bestemmes ved at montere distributionerne af eksperimentelle værdier ved hjælp af lineære kombinationer af simulerede fordelinger. Vi demonstrerer nytten af vores protokol ved at løse de åbne systemer tilstande af et protein, der udviser forskellige difpulsive tilstande ved at danne homo-og hetero-oligomeriske komplekser i cytosol af et bakterielt patogen.

Introduction

Ved at undersøge den difeksive opførsel af biomolekyler giver indsigt i deres biologiske funktioner. Fluorescens mikroskopi baserede teknikker er blevet værdifulde værktøjer til observation af biomolekyler i deres oprindelige cellemiljø. Fluorescens genfinding efter foto blegning (FRAP) og fluorescens korrelations spektroskopi (FCS)1 giver ensemble-gennemsnit diffusiv adfærd. Omvendt, enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi muliggør observation af individuelle fluorescently mærkede molekyler med høj rumlig og tidsmæssig opløsning2,3,4. Observere individuelle molekyler er fordelagtigt, da et protein af interesse kan eksistere i forskellige difpulsive stater. F. eks. opstår der to let skelnelige difspøse tilstande, når en transkriptional regulator, såsom CueR i Escherichia coli, spreder sig frit i cytosol eller binder sig til en DNA-sekvens og bliver immobiliseret på måle tidsskalaen5 . Single-molekyle tracking giver et værktøj til at observere disse forskellige stater direkte, og sofistikerede analyser er ikke forpligtet til at løse dem. Det bliver dog mere udfordrende at løse flere difpulsive tilstande og deres befolknings fraktioner i tilfælde, hvor deres difpulsive rater er mere ens. For eksempel, på grund af størrelsen afhængighed af diffusions koefficienten, forskellige oligomeriserings tilstande af et protein manifestere sig som forskellige diffusionsstater6,7,8,9 , 10. sådanne tilfælde kræver en integreret tilgang med hensyn til dataindsamling,-behandling og-analyse.

En kritisk faktor, der påvirker difpulsive rater af cytosolisk molekyler er effekten af indeslutning ved celle grænsen. Restriktionerne for molekyl bevægelse ved en bakteriecelle grænse bevirker, at en cytosolisk molekyle målte diffusionshastighed forekommer langsommere, end hvis der var forekommet samme bevægelse i et uafgrænset rum. For meget langsomt sprede molekyler, effekten af cellulær indespærring er ubetydelig på grund af manglende kollisioner med grænsen. I sådanne tilfælde kan det være muligt præcist at løse diffusions tilstande ved at montere Fordelingerne af molekylære forskydninger, reller tilsyneladende diffusionskoefficienter, D *, ved hjælp af analytiske modeller baseret på ligningerne for brownian motion ( tilfældig diffusion)11,12,13. Men for hurtig sprede cytosolisk molekyler, de eksperimentelle distributioner ikke længere ligner dem, der opnås for uindskrænket brune bevægelse på grund af kollisioner af sprede molekyler med cellegrænser. Der skal redegøres for indeslutning for at bestemme de uafgrænsede diffusions koefficienter for de fluorescentreret molekyler. Flere tilgange er for nylig blevet udviklet for at højde for indeslutning virkninger enten (semi-) analytisk 5,14,15,16 eller numerisk gennem Monte Carlo simuleringer af Brownian diffusion6,10,16,17,18,19.

Her leverer vi en integreret protokol til indsamling og analyse af enkelt molekyle lokaliserings mikroskopi data med særligt fokus på sporing af enkelt molekyle. Det endelige mål med protokollen er at løse diffløse tilstande af fluorescently mærket cytosolisk proteiner inde, i dette tilfælde, stang formede bakterieceller. Vores arbejde bygger på en tidligere protokol for single-molekyle tracking, hvor en DNA Polymerase, PolI, viste sig at eksistere i en DNA-bundet og ubundet tilstand ved diffusion analyse20. Her udvider vi sporings analyser med et enkelt molekyle til 3D-målinger og udfører mere realistiske beregningsmæssige simuleringer for at løse og kvantificere flere åbne systemer tilstande, som samtidig findes i celler. Dataene er erhvervet ved hjælp af en hjem-bygget 3D super-resolution fluorescens mikroskop, som er i stand til at bestemme 3D-positionen af fluorescerende udledere ved billeddannelse med dobbelt-helix punkt-Spread-funktion (dhpsf)21,22. De rå single-molekyle billeder er behandlet ved hjælp af brugerdefinerede-skrevet software til at udtrække 3D enkelt-molekyle lokaliseringer, som derefter kombineres i enkelt-molekyle forløbskurver. Tusinder af forløbskurver samles for at generere fordelinger af tilsyneladende diffusions koefficienter. I et sidste trin, de eksperimentelle distributioner er egnet med numerisk genererede fordelinger opnået gennem Monte-Carlo simuleringer af Brunisk bevægelse i en begrænset volumen. Vi anvender denne protokol til at løse de åbne systemer tilstande af type 3 sekretions system protein yscq i levende Yersinia enterocolitica. På grund af sin modulære karakter, vores protokol er generelt gældende for enhver form for enkelt-molekyle eller single-partikel tracking eksperiment i vilkårlig celle geometrier.

Protocol

1. dobbelt-helix punkt-Spread-funktion kalibrering Bemærk: billeder beskrevet i dette og de følgende afsnit er erhvervet ved hjælp af en specialbygget inverteret fluorescens mikroskop, som beskrevet i Rocha et al.23. Den samme procedure er gældende for forskellige mikroskop implementeringer designet til enkelt-molekyle lokalisering og sporing mikroskopi2,3,4. Al software til …

Representative Results

Under de eksperimentelle betingelser, der er beskrevet her (20.000 rammer, mindst 4 lokaliseringer af forløbs længde) og afhængigt af udtryks niveauerne for de fluorescently mærkede fusions proteiner, giver ca. 200-3000 lokaliseringer 10-150 der kan genereres forløbskurver pr. celle (figur 2a, b). Et stort antal forløbskurver er nødvendige for at producere en velafprøvet fordeling af tilsyneladende diffusions koefficienter. Størrelse…

Discussion

En afgørende faktor for en vellykket anvendelse af den præsenterede protokol er at sikre, at enkelt-molekyle signaler er godt adskilt fra hinanden (dvs. de skal være sparsomme i rummet og i tid (supplerende MOV. 1)). Hvis der er mere end ét fluorescerende molekyle i en celle på samme tid, kan lokalisering være forkert tildelt til en anden molekyler ‘ bane. Dette kaldes sammenkædning problem30. Eksperimentelle betingelser, såsom protein ekspression niveauer og excitation la…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Alecia Achimovich og ting Yan for kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker ed Hall, Senior videnskabsmand i den avancerede Research computing Services-gruppe på University of Virginia, for at få hjælp til at opsætte de optimerings rutiner, der bruges i dette arbejde. Finansieringen af dette arbejde blev ydet af University of Virginia.

Materials

2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  5. Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
  6. Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
  7. Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
  8. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  9. Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
  10. Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
  11. Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
  12. Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
  13. Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
  14. Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
  15. Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
  16. Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
  17. Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
  18. Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
  19. Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
  20. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
  21. Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
  22. Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
  23. Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
  24. Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
  25. Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
  26. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
  27. Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
  28. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
  29. Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
  30. Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
  31. Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
  32. Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  33. Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
  34. Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
  35. Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
  36. Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
  37. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  38. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  39. Berglund, A. J. Statistics of camera-based single-particle tracking. Physical Review E. 82 (1), 011917 (2010).
  40. Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
  41. English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
  42. Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
  43. Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
  44. Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
  45. Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
  46. Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).

Tags

Single-molecule Tracking3D TrackingDiffusive StatesCytosolic MoleculesFluorescence MicroscopyAgarose PadYersinia EnterocoliticaCell VolumeZ-calibrationMATLABHCImage Live

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image