Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Summary

a microscopia da localização da único-molécula 3D é utilizada para sondar as posições espaciais e as trajetórias do movimento de proteínas cDNAs etiquetadas em pilhas bacterianas vivas. O protocolo de análise experimental e de dados descrito neste documento determina os comportamentos diffusivos prevalentes de proteínas citosómicas baseadas em trajetórias unimoléculas agrupadas.

Abstract

A microscopia da localização da único-molécula sonda a posição e os movimentos de moléculas individuais em pilhas vivas com dezenas de definição temporal espacial e milisecond do nanômetro. Estas capacidades fazem a microscopia da localização da único-molécula serida idealmente para estudar funções biológicas do nível molecular em ambientes fisiologicamente relevantes. Aqui, demonstramos um protocolo integrado para aquisição e processamento/análise de dados de rastreamento de molécula única para extrair os diferentes Estados diffusivos que uma proteína de interesse pode expor. Esta informação pode ser usada para quantificar a formação complexa molecular em células vivas. Fornecemos uma descrição detalhada de uma experiência de localização de molécula 3D baseada em câmera, bem como as etapas subseqüentes de processamento de dados que produzem as trajetórias de moléculas individuais. Essas trajetórias são então analisadas por meio de uma estrutura de análise numérica para extrair os Estados difusivos prevalentes das moléculas rotuladas fluorescentamente e a abundância relativa desses Estados. A estrutura de análise é baseada em simulações estocásticas de trajetórias de difusão brownianas intracelulares que são confinadas espacialmente por uma geometria de célula arbitrária. Com base nas trajetórias simuladas, as imagens de molécula única bruta são geradas e analisadas da mesma forma que as imagens experimentais. Dessa forma, as limitações experimentais de precisão e precisão, que são difíceis de calibrar experimentalmente, são explicitamente incorporadas ao fluxo de trabalho de análise. O coeficiente de difusão e as frações populacionais relativas dos Estados diffusivos prevalentes são determinados ajustando-se as distribuições dos valores experimentais utilizando combinações lineares de distribuições simuladas. Nós demonstramos a utilidade de nosso protocolo resolvendo os Estados difusivo de uma proteína que exiba Estados difusivo diferentes em cima de formar complexos do Homo-e do hetero-oligomeric no citosol de um micróbio patogénico bacteriano.

Introduction

Examinar o comportamento difusivo de biomoléculas fornece a introspecção em suas funções biológicas. Técnicas baseadas em microscopia de fluorescência tornaram-se ferramentas valiosas para observar biomoléculas em seu ambiente de células nativas. A recuperação da fluorescência após o photobranqueamento (Frap) e a espectroscopia da correlação da fluorescência (FCS)¹ fornecem comportamentos difusivo Ensemble-calculados. Inversamente, a microscopia da localização da único-molécula permite a observação de moléculas cDNAs etiquetadas individuais com definição espacial e temporal elevada^2,3,4. Observar moléculas individuais é vantajoso desde que uma proteína do interesse pode existir em Estados difusivo diferentes. Por exemplo, dois Estados difusivo prontamente distinguíveis surgem quando um regulador transcricional, tal como o cubador em Escherichia coli, difunde livremente no citosol ou se liga a uma seqüência do ADN e se torna imobilizado no temporal da medida⁵ . Rastreamento de molécula única fornece uma ferramenta para observar esses diferentes Estados diretamente, e análises sofisticadas não são necessárias para resolvê-los. No entanto, torna-se mais desafiador resolver vários Estados diffusivos e suas frações populacionais nos casos em que suas taxas diffusivas são mais semelhantes. Por exemplo, devido à dependência de tamanho do coeficiente de difusão, diferentes Estados de oligomerização de uma proteína se manifestam como diferentes Estados diffusivos^{6,7,8,9 , 10}. esses casos exigem uma abordagem integrada em termos de aquisição, processamento e análise de dados.

Um fator crítico que influencia as taxas difusivo de moléculas citosólico é o efeito do confinamento pelo limite da pilha. As restrições colocadas no movimento molecular por um limite de células bacterianas causam uma taxa de difusão medida das moléculas citosómicas para parecer mais lenta do que se o mesmo movimento tivesse ocorrido em um espaço não confinado. Para moléculas muito lentamente difuso, o efeito do confinamento celular é insignificante devido à falta de colisões com o limite. Nesses casos, pode ser possível resolver com precisão os Estados diffusivos, ajustando as distribuições de deslocamentos moleculares, rou coeficientes de difusão aparente, D *, utilizando modelos analíticos baseados nas equações para o movimento browniano ( difusão aleatória)^11,12,13. No entanto, para a difusão rápida de moléculas citosómicas, as distribuições experimentais já não se assemelham àquelas obtidas para o movimento browniano não confinado devido a colisões de moléculas de difusão com os limites das células. Os efeitos de confinamento devem ser contabilizados para determinar com precisão os coeficientes de difusão não confinados das moléculas rotuladas fluorescentamente. Várias abordagens foram recentemente desenvolvidas para dar conta dos efeitos de confinamento (semi-) analiticamente ^5,14,15,16 ou numericamente através de simulações de Monte Carlo de Difusão Brownian^{6,10,16,17,18,19}.

Aqui, nós fornecemos um protocolo integrado para coletar e analisar dados da microscopia da localização da único-molécula com um foco particular no seguimento da único-molécula. O objetivo final do protocolo é resolver Estados diffusivos de proteínas citosómicas rotuladas fluorescentamente no interior, neste caso, células bacterianas em forma de haste. Nosso trabalho constrói em um protocolo precedente para o seguimento da único-molécula, em que um polymerase do ADN, PolI, foi mostrado para existir em um estado encadernado e não acoplado do ADN pela análise de difusão²⁰. Aqui, nós expandimos a análise de rastreamento de molécula única para medições 3D e executamos simulações computacionais mais realistas para resolver e quantificar vários Estados diffusivos simultaneamente presentes nas células. Os dados são adquiridos usando um microscópio de fluorescência 3D de super resolução, construído em casa, que é capaz de determinar a posição 3D dos emissores fluorescentes por imagem com a função de propagação de pontos de dupla hélice (dhpsf)^21,22. As imagens RAW de molécula única são processadas usando um software escrito personalizado para extrair as localizações de molécula única 3D, que são combinadas em trajetórias de moléculas únicas. Milhares de trajetórias são agrupadas para gerar distribuições de coeficientes de difusão aparente. Em uma etapa final, as distribuições experimentais são encaixadas com distribuições numericamente geradas obtidas através de simulações de Monte-Carlo de movimento browniano em um volume confinado. Nós aplicamos este protocolo para resolver os Estados difusivo do tipo-3 proteína yscq do sistema da secreção em viver Yersinia enterocolitica. Devido à sua natureza modular, nosso protocolo é geralmente aplicável a qualquer tipo de experimento de rastreamento de única molécula ou de partículas únicas em geometrias de células arbitrárias.

Protocol

1. calibração do ponto-propagação-função da dobro-hélice Nota: as imagens descritas neste e as secções seguintes são adquiridas através de um microscópio de fluorescência invertido personalizado, conforme descrito em rocha et al.23. O mesmo procedimento é aplicável às implementações diferentes do microscópio projetadas para a localização da único-molécula e a microscopia de seguimento2,3,4<s…

Representative Results

as condições experimentais descritas aqui (20.000 frames, comprimento mínimo da trajetória de 4 localizações) e dependendo dos níveis da expressão das proteínas cDNAs etiquetadas da fusão, aproximadamente 200-3000 localizações que rendem 10-150 trajetórias podem ser geradas por célula (Figura 2a, b). Um grande número de trajetórias é necessário para produzir uma distribuição bem amostrada de coeficientes de difusão aparen…

Discussion

Um fator crítico para a aplicação bem sucedida do protocolo apresentado é assegurar-se de que os sinais da único-molécula estejam bem separados de se (isto é, precisam de ser esparsos no espaço e no tempo (Mov. 1 suplementar)). Se houver mais de uma molécula fluorescente em uma célula ao mesmo tempo, então a localização pode ser incorretamente atribuída à trajetória de outras moléculas. Isto é referido como o problema de ligação³⁰. As condições experimentais,…

Materials

2,6-diaminopimelic acid	Chem Impex International	5411	Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, 2"
514 nm laser	Coherent	Genesis MX514 MTM	Use for fluorescence excitation
agarose	Inivtrogen	16520100	Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingredient.
bandpass filter	Chroma	ET510/bp	Excitation pathway.
Brain Heart Infusion	Sigma Aldrich	53286	Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride	Sigma Aldrich	223506	M2G ingredient.
camera	Imaging Source	DMK 23UP031	Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask	Double Helix, LLC	N/A	Produces DHPSF signal.
disodium phosphate	Sigma Aldrich	795410	M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror	Newport	8892-K	Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres	Invitrogen	F8792	Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip	VWR	16004-302	#1.5, 22mmx22mm
glucose	Chem Impex International	811	M2G ingredient.
immersion oil	Olympus	Z-81025	Placed on objective lens.
iron(II) sulfate	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingredient.
long pass filter	Semrock	LP02-514RU-25	Emission pathway.
magnesium sulfate	Fisher Scientific	S25414A	M2G ingredient.
microscope platform	Mad City Labs	custom	Platform for inverted microscope.
nalidixic acid	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Ozone cleaner	Novascan	PSD-UV4	Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate	Sigma Aldrich	795488	M2G ingredient.
Red LED	Thorlabs	M625L3	Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	Camera for fluorescence imaging.
short pass filter	Chroma	ET700SP-2P8	Emission pathway.
Tube lens	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate	Thorlabs	WPQ05M-514	Excitation pathway.