Un protocollo dello schermo mutante di segnalazione della forza di manodopera e ripetibile per lo studio della Thigmomorphogenesis di un modello di arabidopsis thaliana
Summary
Una delicata macchina di caricamento touch-force è costruita da spazzole per capelli umani, bracci robotici e un controller. Le spazzole per capelli sono azionate da bracci robotici installati sulla macchina e si muovono periodicamente per applicare la forza tocco sulle piante. La forza dei tocchi di capelli guidati da macchine è paragonabile a quella dei tocchi applicati manualmente.
Abstract
Piante che rispondono a stimolazioni meccaniche intracellulari ed extracellulari (o segnali di forza) e sviluppano speciali cambiamenti morfologici, una chiamata thigmomorfogenesi. Negli ultimi decenni, diversi componenti di segnalazione sono stati identificati e segnalati per essere coinvolti nella meccanotra (ad esempio, proteine che legano gli ioni di calcio ed enzimi di biosintesi dell’acido jasmonico). Tuttavia, il ritmo relativamente lento della ricerca nello studio della segnalazione della forza o della tigmomorfogenesi è in gran parte attribuito a due motivi: il requisito per l’induzione del tocco manipolato a mano umano della thigmomorfogenesi e gli errori di forza della forza associato al tocco delle persone. Per migliorare l’efficienza del carico di forza esterna su un organismo vegetale, è stata costruita una macchina di carico automatico touch-force. Questo pennello robotico a braccio-driven fornisce una simulazione touch-force salvabile e facilmente ripetibile, cicli illimitati di ripetizione tramite tocco e forza di tocco regolabile. Questa macchina per il caricamento a pressione dei capelli può essere utilizzata sia per lo screening su larga scala dei mutanti di segnalazione a forza di tatto sia per lo studio della fenomica della tigmomorfogenesi delle piante. Inoltre, materiali tattili come i capelli umani, possono essere sostituiti con altri materiali naturali come i peli di animali, fili di seta e fibre di cotone. I bracci mobili automatizzati sulla macchina possono essere dotati di ugelli di spolverata d’acqua e soffiatori d’aria per imitare le forze naturali delle gocce di pioggia e del vento, rispettivamente. Utilizzando questa macchina di carico automatica per il tocco di capelli in combinazione con il tappi di cotone eseguito a mano, abbiamo studiato la risposta al tocco di due mutanti di segnalazione di forza, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) e MKK2 impianti . I fenomi delle piante di tipo selvaggio caricate a motore e due mutanti sono stati valutati statisticamente. Hanno mostrato differenze significative nella risposta al tocco.
Introduction
La thigmomorfogenesi vegetale è un termine che è stato coniato da Jaffe, MJ nel 19731. È un tropismo vegetale ma diverso dal noto fototropismo o gravitropismo causato da stimoli di luce solare o gravità2,3. Descrive alterazioni fenotipiche associate a stimolazioni meccaniche periodiche, che sono state frequentemente osservate dai botanici in tempi precedenti4,5. Gocce di pioggia, vento, piante, tocchi animali e umani, anche morsi di animali, sono tutti considerati diversi tipi di mechano-stimoli che innescano la segnalazione della forza nelle piante4,5. Le caratteristiche della thigmomorphogenesis comprendono il ritardo di bullonatura, uno stelo più corto, la dimensione più piccola di rosette/foglia nelle piante erbacee e uno stelo più spesso nelle piante legnose6,7,8. Questo è diverso dalla risposta tigmonastica o tigmotropica che si trova spesso nella pianta di Mimosa o in altre viti sensibili al meccano, dove queste risposte rapide al tatto sono più facili da osservare1,9,10. La thigmomorfogenesi, d’altra parte, è relativamente difficile da osservare a causa della sua lenta risposta alla crescita. La thigmomorfogenesi è di solito osservata dopo settimane o addirittura anni di stimolazione continua del caricamento della forza. Questa natura unica della risposta al tocco delle piante rende difficile eseguire uno schermo genetico in avanti utilizzando la stimolazione del tocco della mano umana per isolare i mutanti resistenti alla segnalazione della forza touche in modo robusto.
Per chiarire le vie di trasduzione del segnale di forza e i meccanismi molecolari alla base della tigmomorfogenesi6,11, esperimenti biologici molecolari e cellulari sono stati eseguiti negli ultimi6, 12,13,14. Questi studi hanno proposto che i recettori del segnale di forza vegetale consistono principalmente di canali ionici meccanosensitive (MSC) e complessi MSC legati composti da complessi multimerici di proteine che si estendono a membrana11,14 , 15.Il picco transitorio citoplasma Ca2 o generato in pochi secondi dal tocco iniziale. Vento, pioggia-, o gravi-stimolazione può interagire con i sensori di calcio a valle per trasdurre i segnali di forza agli eventi nucleari14,16,17,18. Oltre agli studi molecolari e cellulari, lo schermo genetico in avanti con tocco manuale delle piante ha scoperto che i fitoormoni e i metaboliti secondari sono coinvolti nella conseguente espressione genica tramite terrore (TCH) carico touch-force13,19. Ad esempio, aos e opr320 mutanti sono stati identificati finora dagli studi genetici. Tuttavia, il problema principale associato all’applicazione della genetica avanzata nello studio della thigmomorfogenesi è ancora il lavoro intensivo necessario per quantificare il livello di risposta al tatto e toccare una grande popolazione di geneticamente mutati singole piante. Il problema che richiede molto tempo persiste anche nello schermo mutante a contatto a mano14,20. Per un esempio, per completare un round di stimolazione della forza di tocco, una persona deve toccare 30-60 volte (un tocco al secondo) su una singola pianta. Per avere un numero sufficiente di piante per l’analisi statistica del fenotipo, per il processo di caricamento della forza touch sono normalmente necessari 20-50 singoli impianti dello stesso genotipo. Questo regime di caricamento touch-force significa che una persona ha bisogno di eseguire ripetutamente 600-3.000 tocchi su un genotipo di scelta. Questo tipo di tocco normalmente deve essere ripetuto da 3 a 5 colpi al giorno, che equivale a circa 1.800-15.000 dita o tocchi di cotone tocchi di cotone al giorno per genotipo di piante. Una persona ben addestrata è normalmente necessaria per mantenere la forza e la forza di tocchi multipli all’interno di una gamma desiderabile attraverso molti cicli di ripetizione in un giorno per evitare la grande variazione di forza e forza. Come è ben noto che la tigmomorfogenesi è un processo saturabile e dose-dipendente6,21, forza tocco / forza diventa fondamentale per un successo nell’attivazione della risposta al tocco di una pianta.
Per rimuovere il caricamento a passo toccato dipendente dalla persona e mantenere l’applicazione meccanica entro un intervallo di errore accettabile14,abbiamo quindi progettato una macchina di caricamento automatico a forza di tatto per sostituire i tocchi manipolati a mano. La macchina ha 4 bracci in movimento costruiti, ognuno dei quali è dotato di una spazzola per capelli umana. Questa versione è denominata Modello K1 per specificare la sua caratteristica del caricamento tatto-forza dei capelli umani. Se 4 genotipi sono misurati quantitativamente per la loro tigmomorfogenesi o risposta al tatto sotto una macchina, 40-48 individui per genotipo possono essere misurati. Ogni ripetizione del tocco (meno di 60 volte di tocco per pianta) dura meno di 5 minuti utilizzando un braccio robotico regolabile a velocità in movimento. Così, gli impianti su una macchina touch model K1 possono essere stimolati meccanicamente per più round al giorno, con un carico costante di touch-force o diversi livelli di forza inizialmente programmati.
L’Arabidopsis thaliana, un organismo vegetale modello, è stata quindi scelta come specie vegetale bersaglio per testare l’applicazione della macchina di carico a motore touch-force dei capelli completamente automatica. Poiché ci sono diverse grandi sementi disponibili per il recupero dei vari germplasmi di mutanti e delle dimensioni della fioritura, l’Arabidopsis si adatta bene allo spazio disponibile nella mensola di crescita montata con la macchina touch Model K1.
La macchina a sfioramento automatico Model K1 è composta da tre componenti principali: (1) il rack metallico a forma di H composto da due attuatori lineari a nastro, (2) bracci metallici robotici dotati di spazzole per capelli e (3) un controller. Per una macchina touch model K1 personalizzata, ogni modulo dell’asse X/Y è composto da una guida-rail guidata da cintura, due blocchi di scorrimento (rosso) e un motore da 57 stepper (preinstallato e smontabile) (Figura 1A,B). L’attuatore orizzontale superiore permette al braccio metallico robotico di muoversi a sinistra ea destra orizzontalmente, l’attuatore lineare con cintura verticale inferiore consente al braccio metallico robotico di muoversi su e giù verticalmente (Figura 1B, Figura 2A ). Nell’attuatore verticale sono stati installati quattro bracci robotici smontabili (Figura 1C, Figura 2B). Quattro spazzole per capelli umane erano legate a quattro bracci robotici, rispettivamente (Figura 1C, Figura 2B). Tutte le parti meccaniche per costruire la macchina touch Model K1 in grassetto riportato di seguito sono contrassegnate nella Figura 1C (vedere anche la tabella dei materiali).
Protocol
Representative Results
Discussion
La thigmomorfogenesi è una risposta complessa alla crescita delle piante verso le perturbazioni meccaniche, che coinvolge una rete di segnalazione cellulare e l’azione dei fitoormoni. È una conseguenza dell’evoluzione adattativa delle piante per sopravvivere sotto le condizioni ambientali indesiderabili25,26. Il tocco meccanico, in particolare il tocco delle dita umane e il tocco di tampone di cotone portatile, sono stati selezionati per studiare questi cambiam…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: 31370315, 31570187, 31870231 (Fondazione Nazionale della Scienza della Cina), 16100318, 661613, 16101114, 16103615, 16103817, AoE/M-403/16 (Hong Kong). Gli autori desiderano ringraziare Ju Feng Precision and Automation Technology Limited (Shenzhen, Cina) per la loro offerta di diversi schemi illustrati nella Figura 1.
Gli autori desiderano anche ringraziare S. K. Cheung e W. C. Lee per il loro contributo allo sviluppo della macchina di caricamento touch-force.
Materials
| 4 hair brushes | customized | ||
| 4 robot arms with one holder | customized | 1000 mm length holder and 560 mm length robot arm | |
| 57 stepper motor | 57HS22-A | ||
| All purpose potting soil | Plantmate, Hong Kong | ||
| Arabidopsis plant seeds | Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH | For arabidopsis seed purchase | |
| BIO-MIX potting substratum | Jiffy Products International BV, the Netherlands | 1000682050 | Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and BIO-MIX is 1:2 |
| IL 1700 research radiometer | International Light, Newburyport, MA | The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured. | |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Free downloaded software | |
| Ju Feng Precision and Automation Technology Limited | Shenzhen, China | For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase | |
| Junction plate of the slide block | To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks | ||
| Junction plate of the X axis module | customized | To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder | |
| Slide block | |||
| WDT4045 X axis guide-rail module | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| WDT4045 Y axis guide-rail module | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor | |
| X axis auxiliary girder | 843 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks | |
| Y axis auxiliary girder | 1038 mm, customized | Pre-installed with two slide blocks |
Riferimenti
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