Opsonophagocytic drepe analysen å vurdere immunologiske svar mot bakteriell patogener
Summary
Denne opsonophagocytic drepe analysen brukes til å sammenligne evne til phagocytic immunceller svare og drepe bakterier basert på ulike behandlinger og/eller betingelser. Klassisk, fungerer denne analysen som gullstandarden for vurdering funksjoner effektor av antistoffer reist mot en bakterie som opsonin.
Abstract
En viktig del av immunforsvaret til bakteriell kolonisering av verten er fagocytose. Opsonophagocytic drepe analysen (OPKA) er en eksperimentell prosedyre der phagocytic cellene er co kulturperler med bakteriell enheter. Immunceller vil phagocytose og dreper bakteriekulturer i en komplement-avhengige måte. Effektiviteten av immun-mediert celle drapet er avhengig av flere faktorer og kan brukes til å bestemme hvordan ulike bakteriell kulturer sammenligne med hensyn til motstand mot celledød. På denne måten kan effekten av potensielle immun-baserte therapeutics vurderes mot spesifikke bakteriell stammer og/eller serotyper. I denne protokollen beskriver vi en forenklet OPKA som benytter grunnleggende oppdrettsforholdene og celle teller for å fastslå bakteriell celle levedyktighet etter co kultur med behandling betingelser og HL-60 immunceller. Denne metoden har blitt vellykket utnyttet med en rekke forskjellige pneumokokk serotyper, capsular og acapsular stammer, og andre bakterie-art. Fordelene med denne OPKA protokollen er dens enkelhet, allsidighet (som denne analysen ikke er begrenset til antistoff behandlinger som opsonins), og minimering av tid og reagenser å vurdere eksperimentelle standardgrupper.
Introduction
Opsonophagocytic drepe analysen (OPKA) er et kritisk verktøy for å koble endringer i bakteriell strukturen eller funksjon til etterfølgende endringer i immunforsvaret og funksjon. Som sådan, er det ofte brukt som en komplementær analysen for å bestemme immun-baserte effekten av antistoff behandlinger, vaksine kandidater, enzym optimalisering, etc. Mens i vivo analyser er nødvendig for å bestemme effektiv klarering eller beskyttelse i en bakteriell infeksjon modell, OPKA kan brukes til å vurdere immun bidrag til bakteriell celledød på de grunnleggende komponentene: bakterier, immunceller, og eksperimentelle behandlinger. Tidligere studier har vist at OPKAs kan endres og brukes til en rekke bakterier og serotyper, inkludert Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Videre kan disse optimalisert analyser brukes til å vurdere ulike eksperimentelle behandlinger, inkludert muligheten for et enzym å gjøre bakterien mer tilgjengelig for komplement-mediert immunceller4 og antistoff behandlinger for å forbedre opsonization5. Tradisjonelt OPKA analysen har blitt brukt i grunnleggende og klinisk forskning som en mektig indikator for beskyttelse indusert av patogen-spesifikke antistoffer6,7,8,9 .
Ulike immunceller kan brukes for vurdering av opsonophagocytic drap. En brukte phagocytic befolkningen er HL-60 human leukemic celle linjen. Denne cellen linjen kan holdes som deaktivert promyelocytes i kultur; Imidlertid kan de differensieres i ulike aktivert stater via ulike behandlinger10,11. Behandling av HL60 n, N-vannistedenfor skiller celle linjen i aktivert nøytrofile med sterke phagocytic aktivitet11. Mens HL-60 celler er optimalisert og brukes ofte for disse fagocytose analyser10, kan andre primære polymorfonukleære leukocytter brukes som immun armen av eksperimentet12.
I tillegg disse analyser kan være forenklet13 eller multiplekset14 å se på flere antibiotika-resistente stammer av bakterier skal testes. Metoden multiplex er gjort mer mulig gjennom utvikling av programvare som kan effektivt telle bakterie kolonien danner enheter (CFUs) per plass på en agar plate15. Her beskriver vi en strømlinjeformet metode som bruker en bakteriell stamme, HL-60 celler, baby kaninen supplement og blod agar plater. Med denne metoden kan flere behandlinger vurderes raskt for å løse spesifikke problemstillinger på hvordan medfødte immunforsvaret til bakteriell infeksjon kan være modulert.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs tjene viktige roller i å vurdere antistoff mediert immunreaksjoner indusert av vaksiner6,8. Viktigste betydningen av dette forenklet OPKA er tilpasningsevne i forhold til testes (dvs. antistoffer, enzym behandlinger, etc.). I denne forstand, mens denne analysen kan brukes til å teste bidrag av opsonins (dvs. antistoffer) i fagocytose, kan det også brukes til å vurdere måter å overvinne virulens faktorer (dvs. capsular polysakkarider) som normalt hemme…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) for hans uvurderlig hjelp i å etablere OPKA analyser i vårt laboratorium. Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse Grant 1R01AI123383-01A1 til FYA.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
Riferimenti
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
