Novel, immunostaining-kompatible vev clearing teknikker som den ultimate 3D Imaging av løsemiddel-ryddet organer tillate 3D visualisering av rabies virus hjerneinfeksjon og komplekse cellulære miljø. Tykk, antistoff-merket hjernevevet skiver er gjort optisk transparent å øke Imaging dybde og for å muliggjøre 3D analyse av konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi.
Visualiseringen av infeksjons prosesser i vev og organer ved immunolabeling er en nøkkel metode i moderne infeksjons biologi. Evnen til å observere og studere fordelingen, tropism, og overflod av patogener innsiden av organ vev gir avgjørende data om sykdomsutvikling og progresjon. Ved hjelp av konvensjonelle mikroskopi metoder, er immunolabeling stort sett begrenset til tynne seksjoner Hentet fra parafin-embedded eller frosne prøver. Imidlertid kan den begrensede 2D bildet flyet av disse tynne seksjoner føre til tap av viktig informasjon om den komplekse strukturen i en infisert organ og cellulær sammenheng med infeksjonen. Moderne flerfarget, immunostaining-kompatible vev clearing teknikker nå tilby en relativt rask og rimelig måte å studere høyt volum 3D-bilde stabler av virus-infiserte organ vev. Ved å utsette vevet for organiske løsemidler, blir det optisk transparent. Dette matcher utvalgets brytnings indekser og fører til slutt til en betydelig reduksjon av lysspredning. Således, inne kombinasjonen med lang ledig arbeider avstand målsettinger, stor tissue deler til 1 mm inne størrelse kan avbildet av tradisjonell konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi (CLSM) for høy resolution. Her over, vi beskrive en protokollen å søke dyp-tissue tenkelig etter tissue oppryddingen å visualisere rabiat virus distribusjon inne infisert hjerne for at studere emner like virus patogenesen, spre, tropism, og neuroinvasion.
Konvensjonelle histologi teknikker meste stole på tynne deler av orgel vev, som kan iboende gir bare 2D innsikt i en kompleks 3D-miljø. Selv gjennomførbart i prinsippet, 3D rekonstruksjon fra serielle tynne seksjoner krever krevende tekniske rørledninger for både kutting og påfølgende i silisiummangan justering av ervervet bilder1. Videre er sømløs rekonstruksjon av z-volumer etter mikrotomen kutting kritisk, da både mekaniske og beregnings gjenstander kan forbli på grunn av suboptimal bilde registrering forårsaket av nonoverlapping bilde plan, fargevariasjoner og fysiske ødeleggelse av vev av for eksempel mikrotomen bladet. I kontrast, ren optisk kutting av intakt tykke vevsprøver gjør at oppkjøpet av overlappende bilde plan (oversampling) og dermed Letter 3D rekonstruksjon. Dette i sin tur er svært gunstig for analyse av smitte prosesser i komplekse celle populasjoner (f. eks neuronal nettverk i sammenheng med de omkringliggende gliacellene og immunceller). Men iboende hindringer av tykt vev seksjoner inkluderer lysspredning og begrenset antistoff penetrasjon inn i vevet. I de senere årene har en rekke teknikker er utviklet og optimalisert for å overvinne disse problemene2,3,4,5,6,7,8 , 9 andre priser , 10 andre , 11 flere , 12 flere , 13. i hovedsak er målet vev slått optisk transparent ved behandling med enten vandig2,3,4,5,6,7 ,8,9 eller organiske løsningsmiddel BASert 10,11,12,13 løsninger. Innføringen av 3DISCO (3D Imaging av løsemiddel-ryddet organer)11,12 og dens etterfølger uDISCO (ultimate 3D Imaging av løsemiddel-ryddet organer)13 ga en relativt rask, enkel og rimelig verktøy med utmerket clearing evner. De viktigste bestanddelene av clearing-protokollen er organiske løsemidler tert-BUTANOL (TBA), benzylalkohol alkohol (ba), benzylalkohol BENZOATE (bb), og difenyleter ETER (DPE). Utviklingen og tillegg av iDISCO (immunolabeling 3D-avbildning av løsningsmiddel klarerte organer)14, en kompatibel immunostaining-protokoll, utgjorde en annen fordel i forhold til eksisterende metoder og aktiverte den dype vevs merkingen av antigener av interesse, samt langtidslagring av immunostained prøver. Kombinasjonen av iDISCO14 og uDISCO13 gir således Høyoppløselig bilde av antistoff-merket proteiner i store vevs seksjoner (opptil 1 mm) ved bruk av konvensjonelle CLSM.
Bevaring av et organ er kompleks struktur i alle tre dimensjoner er spesielt viktig for hjernevevet. Neurons utgjør en svært heterogen mobilnettet pasientpopulasjonen med svært varierte 3D-morfologier basert på deres neurite anslag (gjennomgått av Masland15). Videre består hjernen av en rekke avdelinger og subcompartments, hver bestående av forskjellige cellulære subpopulasjoner og forhold derav, inkludert gliacellene celler og neurons (gjennomgått av von Bartheld et al.16). Som neurotropisk virus, den rabies virus (RABV, gjennomgått av Fooks et al.17) infiserer hovedsakelig neurons, bruker deres transport maskiner til å reise i retrograd retning langs axons fra den primære stedet for smitte til sentralnervesystemet (CNS). Protokollen som beskrives her (figur 1A) tillater immunostaining-assistert deteksjon og VISUALISERING av RABV og RABV-infiserte celler i store, sammenhengende bilde stabler Hentet fra infiserte hjernevev. Dette muliggjør en objektiv, 3D høyoppløselig vurdering av infeksjons miljøet. Det er aktuelt å hjernevev fra en rekke arter, kan utføres umiddelbart etter fiksering eller etter langtidslagring av prøver i paraformaldehyde (PFA), og tillater lagring og reimaging av farget og ryddet prøver i månedsvis.
Den gjenopplivet og videre utvikling av vev clearing teknikker i de siste årene2,3,4,5,6,7,8, 9 andre priser , 10 andre , 11 flere , 12 flere ,</s…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Thomas C. Mettenleiter og Verena te kamp for kritisk lesing manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Federal Excellence Initiative av Mecklenburg Vest-Pommern og European Social Fund (ESF) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) og en intramural Collaborative forskning stipend på Lyssaviruses på Friedrich-Loeffler-Institutt (ri-0372).
Reagents | |||
Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
Miscellaneous | |||
5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
Technical equipment and software | |||
3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
Primary antibodies | |||
Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
Secondary antibodies | |||
Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |