Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro
Summary
Novel, técnicas de compensação de tecido compatível com imunocoloração, como a imagem 3D final de órgãos com solventes limpos, permitem a visualização 3D da infecção cerebral pelo vírus da raiva e seu ambiente celular complexo. As fatias grossas, anticorpo-etiquetadas do tecido de cérebro são feitas opticamente transparentes para aumentar a profundidade da imagem latente e para permitir a análise 3D pela microscopia confocal da exploração do laser.
Abstract
A visualização de processos de infecção em tecidos e órgãos por imunolabeling é um método-chave na biologia da infecção moderna. A capacidade de observar e estudar a distribuição, tropismo e abundância de patógenos dentro de tecidos de órgãos fornece dados cruciais sobre o desenvolvimento e progressão da doença. Usando métodos convencionais da microscopia, Immunolabeling é restringido na maior parte às seções finas obtidas das amostras parafina-encaixadas ou congeladas. No entanto, o plano de imagem 2D limitado dessas seções finas pode levar à perda de informações cruciais sobre a estrutura complexa de um órgão infectado e o contexto celular da infecção. As técnicas multicolor, immunomancha-compatíveis modernas do esclarecimento do tecido fornecem agora uma maneira relativamente rápida e barata de estudar pilhas de imagem 3D high-volume do tecido vírus-contaminado do órgão. Ao expor o tecido a solventes orgânicos, torna-se opticamente transparente. Isso corresponde aos índices de refração da amostra e, eventualmente, leva a uma redução significativa do espalhamento de luz. Assim, em combinação com os objetivos livres longos da distância de trabalho, as grandes seções do tecido até 1 milímetro no tamanho podem ser imaged pela microscopia confocal convencional da exploração do laser (CLSM) na alta resolução. Aqui, nós descrevemos um protocolo para aplicar a imagem latente do profundo-tecido após o esclarecimento do tecido para visualizar a distribuição do vírus de raiva em cérebros contaminados a fim estudar tópicos como a patogénese, a propagação, o tropism, e o neuroinvasion do vírus.
Introduction
As técnicas convencionais da histologia confiam na maior parte em seções finas de tecidos do órgão, que podem inerentemente fornecer somente introspecções 2D em um ambiente 3D complexo. Embora viável, em princípio, a reconstrução 3D de seções finas seriais exige condutas técnicas exigentes para fatiar e subsequente no alinhamento silico das imagens adquiridas1. Além disso, a reconstrução sem emenda de z-volumes depois que fatiar do micrótomo é crítica porque os artefatos mecânicos e computacionais podem remanescer por causa do registo suboptimal da imagem causado por planos nonsobrepor da imagem, por variações da mancha, e por física destruição do tecido por, por exemplo, a lâmina do micrótomo. Em contraste, o corte óptico puro de amostras de tecido grosso intacto permite a aquisição de planos de imagem sobrepostas (sobreamostragem) e, assim, facilita a reconstrução 3D. Isso, por sua vez, é altamente benéfico para a análise de processos de infecção em populações de células complexas (por exemplo, redes neuronais no contexto das células gliais e imunes circundantes). Entretanto, os obstáculos inerentes de seções grossas do tecido incluem o espalhamento claro e a penetração limitada do anticorpo no tecido. Nos últimos anos, uma variedade de técnicas foi desenvolvida e otimizada para superar essas questões2,3,4,5,6,7,8 , 9 anos de , 10 de , 11 anos de , 12 anos de , 13. essencialmente, os tecidos-alvo são girados opticamente transparentes pelo tratamento com2,3,4,5,6,7aquosos ,8,9 ou solvente orgânico-baseado10,11,12,13 soluções. A introdução de 3Disco (imagem latente 3D de órgãos solvente-cancelados)11,12 e seu sucessor udisco (imagem latente 3D final de órgãos solvente-cancelados)13 forneceu uma ferramenta relativamente rápida, simples, e barata com excelentes capacidades de compensação. Os principais constituintes do protocolo de compensação são os solventes orgânicos tert-butanol (TBA), álcool benzílico (BA), benzoato de benzilo (BB) e éter DIFENÍLICO (DPE). O desenvolvimento e a adição de iDISCO (Immunolabeling-permitiu a imagem latente 3D de órgãos solvente-cancelados)14, um protocolo de imunomarcação compatível, constituíram uma outra vantagem sobre métodos existentes e permitiram a rotulagem do profundo-tecido dos antígenos de interesse, bem como o armazenamento a longo prazo de amostras imuno-manchadas. Assim, a combinação de iDISCO14 e udisco13 permite a imagem latente de alta resolução de proteínas anticorpo-etiquetadas em grandes seções do tecido (até 1 milímetro) usando CLSM convencional.
A preservação da estrutura complexa de um órgão em todas as três dimensões é particularmente importante para o tecido cerebral. Os neurônios compreendem uma subpopulação celular muito heterogênea com morfologias 3D altamente diversificadas baseadas em suas projeções de neurite (revistas por Masland15). Além disso, o cérebro consiste em vários compartimentos e subcompartimentos, cada um composto por diferentes subpopulações celulares e suas proporções, incluindo células gliais e neurônios (revisados por von Bartheld et al.16). Como um vírus neurotrópico, o vírus da raiva (RABV, revisto por Fooks et al.17) infecta principalmente os neurônios, usando sua maquinaria de transporte para viajar em direção retrógrada ao longo de axônios do local primário de infecção para o sistema nervoso central (CNS). O protocolo aqui descrito (Figura 1a) permite a detecção e visualização assistida por imunocoloração de células infectadas por rabv e rabv em pilhas de imagens grandes e coerentes obtidas de tecido cerebral infectado. Isso permite uma avaliação de alta resolução 3D imparcial do ambiente de infecção. É aplicável ao tecido cerebral de uma variedade de espécies, pode ser realizada imediatamente após a fixação ou após o armazenamento a longo prazo de amostras em paraformaldeído (PFA), e permite o armazenamento e reimagem de amostras manchadas e limpas por meses.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ressurgimento e o desenvolvimento de técnicas de compensação tecidual nos últimos anos2,3,4,5,6,7,8, 9 anos de , 10 de , 11 anos de , 12 anos de <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Thomas C. Mettenleiter e Verena te Kamp por lerem criticamente o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela iniciativa de excelência Federal de Mecklenburg Pomerânia Ocidental e do Fundo Social Europeu (FSE) Grant KoInfekt (FSE/14-BM-A55-0002/16) e uma subvenção de pesquisa colaborativa intramural sobre lyssavirus na Friedrich-Loeffler-Instituto (ri-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
Riferimenti
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