Högupplöst 3D-avbildning av rabies virus infektion i Lösningsmedelsrensade hjärnvävnad
Summary
Roman, immunofärgning-kompatibel vävnad clearing tekniker som den ultimata 3D-avbildning av lösningsmedel rensas organ tillåter 3D-visualisering av rabiesvirus hjärninfektion och dess komplexa cellulära miljö. Tjocka, antikropp-märkta hjärnvävnad skivor görs optiskt transparent för att öka bildbehandling djup och för att möjliggöra 3D-analys av konfokala laserscanning mikroskopi.
Abstract
Visualisering av infektions processer i vävnader och organ genom immunolabeling är en viktig metod i modern infektionsbiologi. Förmågan att observera och studera distribution, tropism, och överflöd av patogener insidan av orgel vävnader ger centrala uppgifter om sjukdomsutveckling och progression. Med konventionella mikroskopi metoder, immunolabeling är oftast begränsad till tunna sektioner som erhållits från paraffin-inbäddade eller frysta prover. Men den begränsade 2D bildplanet av dessa tunna sektioner kan leda till förlust av viktig information om den komplexa strukturen hos ett infekterat organ och cellulära kontexten av infektionen. Modern Multicolor, immunofärgning-kompatibel vävnad clearing tekniker ger nu ett relativt snabbt och billigt sätt att studera hög volym 3D bild högar av virus-infekterade orgel vävnad. Genom att utsätta vävnaden för organiska lösningsmedel blir den optiskt transparent. Detta matchar provets brytningsindex och leder så småningom till en signifikant minskning av ljusspridningen. Således, i kombination med långa fria arbetsavstånd mål, kan stora vävnad sektioner upp till 1 mm i storlek avbildas med konventionell konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM) med hög upplösning. Här beskriver vi ett protokoll för att tillämpa djup vävnad Imaging efter vävnads clearing att visualisera rabiesvirus distribution i infekterade hjärnor för att studera ämnen som virus patogenes, spridning, tropism, och neuroinvasion.
Introduction
Konventionella histologi tekniker förlitar sig främst på tunna delar av orgel vävnader, som i sig kan ge endast 2D insikter i en komplex 3D-miljö. Även om det är genomförbart i princip kräver 3D-rekonstruktion från seriella tunna sektioner krävande tekniska rörledningar för både skivning och efterföljande i silico-anpassning av de förvärvade bilderna1. Dessutom är sömlös rekonstruktion av z-volymer efter mikrotomen skivning kritisk eftersom både mekaniska och beräkningsmässiga artefakter kan kvarstå på grund av suboptimala bild registrering som orsakas av icke överlappande bild plan, färgning variationer och fysiska nedbrytning av vävnad genom till exempel mikrotomen bladet. I kontrast, ren optisk skivning av intakt tjockt vävnadsprover tillåter förvärvet av överlappande bild plan (översampling) och därmed underlättar 3D-rekonstruktion. Detta, i sin tur, är mycket fördelaktigt för analys av infektions processer i komplexa cellpopulationer (t. ex., neuronala nätverk i samband med omgivande gliaceller och immunceller). Emellertid, inneboende hinder av tjocka vävnad sektioner inkluderar ljusspridning och begränsad antikropps inträngning i vävnaden. Under de senaste åren har en mängd olika tekniker utvecklats och optimerats för att lösa dessa problem2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , elva , 12 , 13. i huvudsak vänds målvävnaderna optiskt transparent genom behandling med antingen vatten2,3,4,5,6,7 ,8,9 eller organiska lösningsmedelsbaserade10,11,12,13 lösningar. Införandet av 3disco (3D-avbildning av lösningsmedelsavklarade organ)11,12 och dess efterträdare udisco (Ultimate 3D Imaging av lösningsmedelsavklarade organ)13 förutsatt en relativt snabb, enkel och billig verktyg med utmärkta clearingmöjligheter. De viktigaste beståndsdelarna i clearingprotokollet är de organiska lösningsmedlen tert-butanol (TBA), bensylalkohol (ba), bensylbensoat (BB) och difenyleter (DPE). Utveckling och tillägg av iDISCO (immunolabeling-aktiverad 3D-avbildning av lösningsmedelsavklarade organ)14, ett kompatibelt immunofärgnings protokoll, utgjorde en annan fördel jämfört med befintliga metoder och möjliggjorde djup vävnads märkning av antigener av intresse, samt långtidslagring av immunfärgade prover. Således möjliggör kombinationen av iDISCO14 och udisco13 för högupplöst avbildning av antikroppsmärkta proteiner i stora vävnads sektioner (upp till 1 mm) med konventionell clsm.
Bevarandet av ett organs komplexa struktur i alla tre dimensionerna är särskilt viktigt för hjärnvävnad. Nervceller utgör en mycket heterogena cellulära subpopulation med mycket varierande 3D morfologier baserat på deras påverkar prognoser (granskas av masland15). Dessutom består hjärnan av ett antal fack och underavdelningar, som vardera består av olika cellulära subpopulationer och förhållanden därav, inklusive gliaceller och neuroner (granskad av von Bartheld et al.16). Som ett neurotropa virus, rabiesvirus (rabv, granskas av fooks et al.17) infekterar främst nervceller, med hjälp av deras transport maskiner att resa i retrograd riktning längs axoner från den primära platsen för infektion till centralanervsystemet (CNS). Det protokoll som beskrivs här (figur 1A) möjliggör immunofärgning-assisterad detektion och visualisering av RABV-och rabv-infekterade celler i stora, sammanhängande bild stackar som erhållits från infekterad hjärnvävnad. Detta möjliggör en opartisk, 3D högupplöst bedömning av infektions miljön. Det är tillämpligt på hjärnvävnad från en mängd olika arter, kan utföras omedelbart efter fixering eller efter långtidslagring av prover i PARAFORMALDEHYD (PFA), och gör det möjligt att lagring och reimaging av färgade och rensas prover i månader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Återkomsten och vidare utvecklingen av vävnads clearingtekniker under de senaste åren2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , elva , 12 , <sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Thomas C. Mettenleiter och Verena te kamp för att kritiskt läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av det federala initiativet för excellens i Mecklenburg-Vorpommern och Europeiska social fonden (ESF) Grant koinfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) och ett interna forskningsanslag på lyssaviruses vid Friedrich-Loeffler-Institutet (RI-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
Riferimenti
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , (2018).
- CDC. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
