トランスミッションベースのノマルスキー型差動干渉造影顕微鏡を用いたプラズモニックナノ粒子の分光法の実行

Summary

このプロトコルの目的は、プラズモニックナノ粒子サンプルの調製のための実績のあるアプローチを詳述し、差動干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡でそれらに単一粒子分光法を行うことです。

Abstract

差動干渉の対照 (DIC) 顕微鏡法は可視範囲ライトを使用してマイクロスケールの目的を撮影するために最も一般に採用される強力なイメージ投射用具である。このプロトコルの目的は、プラズモニックナノ粒子サンプルを調製し、DIC 顕微鏡で単一の粒子分光法を実行するための実証済みの方法を詳述することです。反復可能な分光学実験を行うためには、いくつかの重要ステップを注意深く守らなければならない。まず、ランドマークはサンプル基板にエッチングすることができ、サンプル表面を特定し、実験中に目的の領域を追跡するのに役立ちます。次に、基板は、それ以外の場合には、サンプルの検査を妨げるか、不明瞭な破片や汚染物質を適切に洗浄しなければなりません。試料が適切に調製されたら、コーラー照明を使用して顕微鏡の光路を整列させる必要があります。標準のノマルスキースタイル DIC 顕微鏡では、特にプラズモニックナノ粒子が配向に依存する光学的特性を示す場合、サンプルの回転が必要になることがあります。DIC 顕微鏡検査は、2つの固有の直交偏波フィールドを有するため、波長依存性 DIC 造影パターンは、棒状プラズモニックナノ粒子の配向を明らかにする。最後に、データ収集とデータ分析を慎重に実行する必要があります。DIC ベースの分光データを対比値として表現することが一般的であるが、それを強度データとして提示することも可能である。単粒子分光法における DIC のこのデモでは、球状と棒状の金ナノ粒子に着目しています。

Introduction

1980年代以降、差動干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡は、主に生物科学の中のマイクロスケール物のために確保された重要なイメージング手法として見られるようになった。しかし、1950年代と1960年代の開発の間に、材料科学¹のための技術として意図されていました。近年、プラズモニックナノ粒子に関連する材料科学の進歩に伴い、光学顕微鏡による材料の特性評価への関心が高まっています。

ナノ材料特性評価 (例えば、暗視野、明視野、偏光、蛍光など) には、多くの光学技術が確実に利用可能です。ダークフィールドは、ナノ粒子研究で広く普及しているが、それは散乱の収集にのみ依存し、複雑なサンプル²に関する限られた情報を提供します。蛍光は有用であるが、luminesce または適切に染色することができるサンプルでのみ可能である。DIC 顕微鏡検査は、ナノ粒子の分析のための貴重なツールにするいくつかの特徴を持っています。他の方法およびプラズモニックナノ粒子に関して、DIC の最も頻繁に述べられている利点は、サンプル染色は不要、ハロー効果、浅い被写界深度、高い横方向の解像度³です。また、DIC にはプラズモニックナノ粒子研究に価値のある付加的な強みがあります。まず第一に、2つの固有および直交偏波フィールドが存在し、それらは分光法の目的²のために同時に測定することができる。第二に、ナノ粒子の脱分極しシグナルは最終画像²に捕捉されず、これは暗視野分光測定において重大な懸念の原因となり得る。

本稿の目的は、透過光ノマルスキー DIC 顕微鏡を用いて、プラズモニックナノ粒子の分光分析を行うための明確な方法論を提供することである。DIC は、非常に多様な素材に応用できる力強い技術ですが、ナノ粒子をイメージングする際には、優れた技術と理解を必要とする技術でもあります。トランスミッションベースのノマルスキーには、ここでは簡単に確認できる複雑な光路¹があります。DIC の光学列車が図 1に表示されます。光は、最初に偏光子を通過させることによって顕微鏡を透過し、試料面上に凝縮器によって集束される前にビーム分割ノマルスキープリズム。目的を通過した後、光は、検出器に出る前にビーム結合ノマルスキープリズムとアナライザに遭遇する。2つの偏光子とノマルスキープリズムは DIC 画像の形成に重要であり、DIC の2つの直交偏波フィールド¹を生産するための責任があります。ノマルスキー DIC 顕微鏡の作業原理と光路についての詳細を知りたい読者のために、またはノマルスキー DIC と他のスタイルとの違いについては、これらのトピック¹の他のよく書かれたアカウントを参照してください。^4,5,6,7.

それはノマルスキー DIC、暗視野、または他の顕微鏡技術のいずれかであるかどうか、それらに分光を実行しようとする前に、プラズモニックナノ粒子の基本的な性質を理解することも同様に重要です。プラズモニクスの分野では、ナノ粒子は 10-100 nm^8,9のスケールの寸法を有する微粒子として定義されています。ナノ粒子は、多くの形状 (例えば、球、棒、星、ダンベルなど) を取ることができ、その重要な特性のほとんどは、電磁スペクトルの紫外可視近赤外領域における光との相互作用に起因します。用語「プラズモニック」は、ナノ粒子¹⁰に限定されない。しかしながら、ナノ粒子について論じる際には、局在化した表面プラズモン共鳴 (LSPR) に関して用いられる。LSPR は、ナノ粒子中の伝導電子が、高度に特異的で比較的狭い周波数帯⁸の電磁放射とのクーロン相互作用によって振動する現象である。これらの同じ周波数で、プラズモニックナノ粒子は光の吸収と散乱を増加させ、光学顕微鏡で観察することができます。多くの場合、凝縮器²の前にバンドパスフィルタを配置しながらナノ粒子を観察し、画像化コントラストを改善し、LSPR 効果を誘導しない光を除去することが好ましい。フィルタを用いて、単一粒子分光分析実験を行うこともできる。

LSPR 関連の光学的挙動は、ナノ粒子の大きさや形状に大きく依存し、多くの光学顕微鏡技術で調べることができます。しかしながら、異方性 (すなわち、非球面) 形状のプラズモニックナノ粒子の配向情報を復号するためには、光場の偏光を利用する必要がある。偏光場または試料基板を小さな増分で注意深く回転させることにより、個々のナノ粒子の配向依存性分光特性を監視することができる。回転と偏波は、スペクトル特徴がナノ粒子の表面電子のからまたはより高い次数振動によるものであるかどうかを判断するのにも役立ちます。しかし、等方性 (すなわち球状) ナノ粒子の場合、偏光下で試料を回転させても、スペクトルプロファイルは本質的に変化しないままである。

DIC 顕微鏡を通して見た場合 (図 2)、ナノ粒子は、灰色の背景に影キャスト白と黒の外観と風通しのディスクを持っています。球状ナノ粒子は、回転とバンドパスフィルタの変更でこの外観を保持します。しかし、フィルタの中心波長が球体の唯一のから LSPR 波長¹¹からさらに分離されるにつれて、粒子は徐々に視界から消えていく。ナノロッドの外観は、²を回転させるにつれて劇的に変化することがあります。ナノロッドにはからの動作を持つ2つの LSPR バンドがあり、その位置はナノロッドの物理的寸法に基づいています。ナノロッドの長手方向の軸が DIC 偏波フィールドの1つに平行に配向されている場合、その LSPR 波長に関連付けられたバンドパスフィルタを使用している場合、風通しのいいディスクはすべて白または黒で表示されます。サンプル90°を回転させた後、それは反対の色を取るでしょう。あるいは、ナノロッドの横方向の軸が縦軸に対して垂直であるため、2つの軸の LSPR 波長に一致するフィルターを切り替えるときにロッドは反対の色をとります。他の向きやフィルター設定では、ナノロッドはより球体のように見え、さまざまなシャドウキャスト風通しのいいディスクパターンを提示します。横軸 < ナノロッドの場合、DIC 顕微鏡を用いてその LSPR の波長での信号を検出することは困難です。

単一粒子分光法を実行するには、正しい光学部品を使用し、それらを適切に位置合わせすることが重要です。DIC 顕微鏡検査が可能な目標を使用する必要があります。単一の粒子の実験のために、80x または100x オイルの目的は理想的である。DIC ノマルスキープリズム通常、標準、ハイコントラスト、高解像度の3種類があります。理想的な型は、実験の目的とナノ粒子の大きさに大きく依存する。標準的なプリズムは多くの実験のために罰金である;しかし、より小さいナノ粒子 (< 50 nm) で作業する場合、粒子のコントラストはサイズ¹¹の減少につれて減少するため、ハイコントラストプリズムは有益です。DIC コントラストの調整は、偏光子を回転させるか、または、顕微鏡のブランドまたはモデル⁶に応じて、dic プリズムのいずれかを翻訳することによって達成される。

コーラー照明と偏光子の設定を設定した後、分光データを収集しながらこれらの設定を再調整しないことが重要です。さらに、フィルターと角度の設定を切り替える場合でも、データ収集中は常に一定の平均バックグラウンドシグナルを維持する必要があります。実際の理想的な背景値は、科学カメラのダイナミックレンジに依存しますが、一般に、背景は、カメラの最大検出レベルの 15% ~ 40% の範囲内でなければなりません。これにより、最適なパーティクルコントラストを実現しながら、カメラセンサーが飽和する可能性を低減できます。分光分析データを収集するには、カラーカメラとは対照的に、白黒で画像をキャプチャする科学的なカメラを使用する必要があります。

試料調製は、プラズモニックナノ粒子の画像化のもう一つの重要な側面である。DIC 顕微鏡検査のオペレータは、サンプルの光学特性とサンプルの基板を理解していることが不可欠です。「プレクリーニング」顕微鏡ガラスは、画像化ナノ粒子に十分に調製されておらず、試料の遮るもののない観察を確実にするために試料蒸着前に適切に再洗浄されなければならない。顕微鏡スライドのための多くのクリーニングプロトコルは以前に文書化されています¹², しかし、それは通常、実験的研究で報告されているステップではないです。.

最後に、データ分析法は、単一粒子分光法の最終成分である。各ナノ粒子の最大および最小強度を、局所的な背景平均と同様に測定する必要があります。対象となるパーティクルは、背景破片、基板欠陥、または不均一な照明のないエリアに配置する必要があります。ナノ粒子のスペクトルプロファイルを決定するための1つの方法は、各波長で粒子のコントラストを計算することによって、^11,13,14,15以下の式を使用する。

あるいは、単一の粒子のスペクトルを、DIC の2つの偏波フィールドを表す個々の最大および最小信号成分に分割することができ、それによって2つの同時に収集された方向依存性スペクトルを表示し、2つの式を通して:

Protocol

1. 標準的なガラス顕微鏡のスライドとのサンプル準備 サンプル蒸着用のガラス顕微鏡スライドを準備します。注: 状況によっては、ガラスをエタノールの代わりに超純水に保存する方が適切な場合があります。しかし、水または空気中に貯蔵することは、時間の経過とともにガラスを疎水性にする。 最良の結果を得られるように、ガラスまたは石英顕微鏡のスライドとカバ?…

Representative Results

肉眼で見られるほどの大きさのサンプルを扱う場合、通常はガラス基板上にランドマークを配置する必要はありません。しかし、ナノ材料で作業する場合やサンプルの回転が必要な場合は、ランドマークを使用すると、サンプルの向きを見つけたり、区別したり、追跡したりするための簡単な方法を得ることができます。ガラス基板17上のランドマ?…

Discussion

DIC 顕微鏡で撮像する場合、データを収集する前に光学部品を最適化することが重要です。実験の最中に偏光子を微調整しても、最終データ⁶に大きな影響を与えることがある。さらに、異なる材料は、異なる偏光子設定を必要とする。ここでは大きなステップサイズが偏光角の効果を実証するために利用されていましたが、実際の実験では、最適なコントラスト設定の1° ~ 2 …

Materials

Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol	Fisher Scientific	A962-4	For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips	Ted Pella	260148
Glass microscope slides	Ted Pella	26007
Gold nanorods	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm)	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Nikon Ti-E microscope	Nikon	N/A
Nitrogen gas	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera	Hamamatsu	77054098
Scribing pen	Amazon	N/A	Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water			18 megaohm