Iletim bazlı Nomarski-tipi diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile Plazmonik nanopartiküller üzerinde spektroskopisi gerçekleştirme
Summary
Bu protokolün amacı, Plazmonik nano madde örneklerinin hazırlanması ve diferansiyel girişim kontrastı (DıC) mikroskobu ile tek parçacık spektroskopisi gerçekleştirme konusunda kanıtlanmış bir yaklaşımın ayrıntısı olmaktır.
Abstract
Diferansiyel parazit kontrast (DıC) mikroskopisi, görünür menzilli ışık kullanarak görüntüleme mikroölçekli nesneler için en sık kullanılan güçlü bir görüntüleme aracıdır. Bu protokolün amacı, Plazmonik nano madde örneklerini hazırlamak ve onlara DıC mikroskobu ile tek parçacık spektroskopisi gerçekleştirme konusunda kanıtlanmış bir yöntemin ayrıntısı olmaktır. Tekrarlanabilen Spektroskopi denemeleri yapmak için birçok önemli adım dikkatle izlenmelidir. İlk olarak, simgeler örnek yüzey bulmak ve deneyler sırasında ilgi bölgeyi izleme yardımcı örnek substrat içine kazınmış olabilir. Daha sonra, substrat düzgün bir şekilde arındırılabilir ya da numunenin incelenmesini engelleyen veya belirsiz olan kirleticilerin temizlenmelidir. Bir örnek düzgün hazırlanmış bir kez, mikroskop optik yolu, Kohler aydınlatma kullanarak hizalanmalıdır. Standart Nomarski tarzı DıC mikroskop ile, özellikle Plazmonik nanopartiküller oryantasyona bağlı optik özellikleri gösterdiğinde, numunenin dönüşü gerekli olabilir. DıC mikroskobu iki içsel ortogonal polarizasyon alanına sahip olduğu için, dalga boyu bağımlı DıC kontrast deseni, çubuk şeklinde plasmonik nanopartiküller yönünü ortaya çıkarır. Son olarak, veri edinme ve veri analizlerinin dikkatle gerçekleştirilmesi gerekir. Bir kontrast değeri olarak DıC tabanlı spektroskopisi verileri temsil etmek için yaygındır, ancak yoğunluk verileri olarak sunmak da mümkündür. Tek parçacık spektroskopisi için DıC bu gösterisinde, odak küresel ve çubuk şeklinde altın nano-artiküller üzerinde.
Introduction
1980 ‘ lerden bu yana, diferansiyel parazit kontrast (DıC) mikroskobu büyük ölçüde biyolojik bilimler içinde mikroölçekli nesneler için ayrılmış önemli bir görüntüleme yöntemi olarak görülmektedir. Ancak, 1950 ‘ lerde ve 1960 ‘ larda gelişimi sırasında, malzeme bilimi1için bir teknik olarak amaçlanmıştır. Plasmonik nanopartiküllerle ilgili malzeme bilimlerindeki son gelişmeler ile optik mikroskopiye sahip malzemelerin karakterizasyonu ile ilgili artan bir ilgi yer almıştır.
Birçok optik teknikleri kesinlikle Nanomateryal karakterizasyon için kullanılabilir (örneğin, karanlık alan, Brightfield, polarize ışık, floresan, vb.). Karanlık alan yaygın nanopartikül araştırma popüler, ancak Scatter koleksiyonuna dayanır ve karmaşık örnekler hakkında sınırlı bilgi sağlar2. Floresan kullanışlı olabilir, ancak sadece bu Luminesce veya düzgün lekelenebilir örnekleri ile. DıC microskopi, nanopartiküller analizi için değerli bir araç haline getirmek çeşitli özelliklere sahiptir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında DıC ‘nin en sık belirtilen avantajları ve Plazmonik nanopartiküller şunlardır: hiçbir örnek boyama gerekli, hiçbir Halo efektleri, sığ alan derinliği, ve yüksek lateral çözünürlük3. DıC Plazmonik nano madde araştırması için değerli olan ek güçlere sahiptir. Her şeyden önce, iki içsel ve ortogonal polarizasyon alanları mevcut ve Spektroskopi amacıyla aynı anda ölçülebilir2. İkincisi, Nanopartiküllerin kutuplanma sinyali son görüntü2‘ de yakalanmaz, bu da karanlık alan spektroskopisi ölçümlerinde ciddi bir endişe nedeni olabilir.
Bu makalenin amacı, Plazmonik nanopartiküller üzerinde spektroskopinin gerçekleştirilmesi için iletilen ışık Nomarski DıC mikroskopisini kullanmak için net bir metodoloji sağlamaktır. DıC son derece çeşitli malzemeler için uygulanabilir güçlü bir teknik olmasına rağmen, aynı zamanda görüntüleme nanopartiküller düzgün çalışması için büyük beceri ve anlayış gerektiren bir tekniktir. İletim tabanlı Nomarski DıC mikroskobu sadece kısaca burada gözden geçirilecektir karmaşık bir ışık yolu1 vardır. DıC optik treni Şekil 1‘ de görüntülenir. Işık, ilk olarak bir polarizatör ve bir kiriş bölme Nomarski prizma aracılığıyla geçirilen önce mikroskop yoluyla aktarılır örnek düzlem üzerine kondansatör tarafından odaklanmıştır. Amaç geçtikten sonra, ışık dedektöre çıkmadan önce bir ışın birleştiren Nomarski prizma ve bir analizörü karşılaştığında. İki polarize ve Nomarski prizmalar DıC görüntü oluşumu için kritik ve DIC iki ortogonal polarizasyon alanları üretmek için sorumludur1. Okuyucunun çalışma ilkeleri ve Nomarski DıC microscopes optik yolu hakkında daha fazla bilgi almak için, ya da Nomarski DıC ve diğer STIs diğer stilleri arasındaki farklar hakkında bilgi için, lütfen bu konular1 diğer iyi yazılmış hesapları bakın 4 , 5 , 6 , 7‘ ye kadar.
Onlar Nomarski DıC, karanlık alan veya başka bir mikroskopi tekniği ile olsun, onlara spektroskopisi gerçekleştirmeye çalışmadan önce Plazmonik Nanopartiküllerin temel doğası anlamak için aynı derecede önemlidir. Plazmonik alanında, nanopartiküller 10-100 Nm8,9ölçeğinde ölçümlendirmelere sahip parçacıklar olarak tanımlanır. Nanopartiküller birçok şekil (örneğin, küreler, çubuklar, yıldızlar, dumbbells, vb.) alabilir ve önemli özelliklerinin çoğu elektromanyetik spektrumunun ultraviyole-görünür-yakın kızılötesi aralığında ışık ile etkileşimlerden ortaya çıkabilir. “Plazmonik” terimi nanopartiküller10ile sınırlı değildir; Ancak, nanopartiküller tartışırken, lokalize yüzey plasmon rezonans (LSPR) referans olarak kullanılır. LSPR, yüksek spesifik ve nispeten dar frekans bandı8‘ in elektromanyetik radyasyonuyla Coulombic etkileşimi nedeniyle bir nanopmaddeki iletim elektronlarının osilasyona neden olduğu bir fenomen. Bu aynı frekanslarda, Plazmonik nanopartiküller ışık emilimi ve saçılma artan sergiler, optik mikroskobik ile gözlemlenebilir hale. Birçok durumda, Kondenser2‘ den önce bant geçiren filtreleri yerleştirerek, görüntüleme kontrastı geliştirmek ve LSPR efektini önlemek için başarısız olan ışığı ortadan kaldırmak için nano opartikülleri gözlemlemek tercih edilir. Filtreleri kullanmak da tek parçacık spektroskopisi deneylerini gerçekleştirmenizi mümkün kılar.
LSPR ile ilgili optik davranış, Nanopartiküllerin boyutuna ve şekline son derece bağımlıdır ve birçok optik mikroskopi tekniği ile incelenebilir. Ancak, bir anisotropik (yani, küresel olmayan) şekli ile Plazmonik nanopartiküller oryantasyon bilgilerini deşifre etmek için, ışık alanının polarizasyon kullanmak gereklidir. Polarizasyon alanını veya numune substrat ‘ı küçük artışlarla dikkatle döndürerek, bireysel nanopartiküller için oryantasyona bağlı spektroskopik özellikleri izlemek mümkündür. Rotasyon ve polarizasyon aynı zamanda bir spektral özelliği Nanoparticle yüzey elektronlar bir dipolar veya daha yüksek sipariş salınımı nedeniyle olup olmadığını belirlemede yardımcı olabilir. Ancak, izotropik durumunda (yani, küresel) nanopartiküller, spektral profil aslında polarize ışık altında örnek döndürme üzerine değişmeden kalır.
DıC mikroskop (Şekil 2) ile görüntülendiğinde, nanopartiküller gri bir arka plana karşı gölge dökme beyaz ve siyah bir görünüme sahip havadar bir diske sahiptir. Küresel nanopartiküller bu görünümü rotasyon altında ve bant geçiren filtrelerinin değiştirilmesi ile koruyacaktır; Ancak, filtrenin merkezi dalga boyu, küre ‘nin tek dipolar LSPR dalga boyu11‘ den daha ayrılmış hale geldiği için partiküller giderek görünümden solacak. Nanoçubuklar görünümü,2döndürüldüğü gibi oldukça dramatik bir şekilde değişebilir. Nanoray olan iki LSPR bantları dipolar davranış, konumu nanorods fiziksel boyutları dayanmaktadır. Bir Nanorod boyuna ekseni DIC polarizasyon alanlarından birine paralel olarak yönlendirilmiş olduğunda, havadar disk, LSPR dalga boyu ile ilişkili bir bant geçiren filtresi ile görüntülendiğinde tüm beyaz veya tüm siyah görünecektir. Numuneyi 90 ° döndürdükten sonra, ters rengi alacaktır. Alternatif olarak, bir Nanorod Enine ekseni uzunlamasına eksenine dik olduğundan, iki eksen için LSPR dalga boylarını eşleşen filtreler arasında geçiş yaparken çubuk karşı renk alacaktır. Diğer Oryantasyonlar ve filtre ayarlarında, nanoçubuklar daha fazla küreler gibi görünecektir, çeşitli gölge dökme havadar disk desenleri sunuyor. Enine eksenine sahip nanoçubuklar için 25 Nm <, DIC mikroskobu kullanarak LSPR 'nin dalga boyu sinyalini algılamak zor olabilir.
Tek parçacık spektroskopisi gerçekleştirmek için doğru optik bileşenleri kullanmak ve bunları düzgün şekilde hizalamak önemlidir. DıC microskopi yeteneğine sahip bir objektif kullanılmalıdır. Tek parçacık deneyleri için, 80x veya 100x yağ hedefleri idealdir. Nomarski DıC prizmalar normalde üç çeşit gelir: Standart, yüksek kontrast, ve yüksek çözünürlük. İdeal tip yüksek deney amacına ve nanopartiküller boyutuna bağlıdır. Standart prizmalar birçok deney için iyidir; Ancak daha küçük nanopartiküller (< 50 Nm) ile çalışırken, partikül kontrastı azalır, çünkü partiküller11‘ de azaldığı için yüksek kontrast prizmalar yararlı olabilir. DIC karşıtlığını ayarlamak, bir polarize döndürerek veya mikroskop markasına veya model6‘ ya bağlı olarak DIC prizlerden birini çevirerek elde edilir.
Kohler aydınlatma ve polarize ayarları ayarladıktan sonra, spektroskopi verileri toplama sırasında bu ayarları yeniden değil önemlidir. Ayrıca, filtreler ve açı ayarları arasında geçiş yaparken bile veri toplama sırasında her zaman sabit bir ortalama arka plan sinyali saklanması gerekir. Gerçek ideal arka plan değeri bilimsel kameranın dinamik aralığına bağlıdır, ancak genel olarak, arka plan kameranın maksimum algılama seviyesinin% 15 –% 40 aralığında olmalıdır. Bu, optimum parçacık karşıtlığını etkinleştirirken kamera sensörünün doyurılması olasılığını azaltır. Spektroskopi verileri toplamak için, renkli kamera aksine, siyah ve beyaz görüntüleri yakalar bilimsel bir kamera ile çalışmak gereklidir.
Numune hazırlama plasmonik nanopartiküller görüntüleme başka bir kritik yönüdür. DıC mikroskobu operatörleri numunenin optik özellikleri ve numunenin substrat bir anlayış olması zorunludur. “Önceden temizlenmiş” mikroskop cam yeterli görüntüleme nanopartiküller için hazırlanmış değildir, ve doğru yeniden temizlenmelidir numunenin engelsiz gözlem sağlamak için numune biriktirme önce. Mikroskop slaytlar için birçok temizlik protokolleri daha önce12belgelenmiştir, ancak normalde deneysel çalışmalarda bildirilen bir adım değildir.
Son olarak, veri analizi yöntemleri tek parçacık spektroskopisi için son bileşenidir. Her nano madde için maksimum ve minimum yoğunluklar, yerel arka plan ortalamasının yanı sıra ölçülmelidir. İlgi parçacıkları arka planda enkaz, substrat kusurları veya düzensiz aydınlatma olmayan alanlarda yer olmalıdır. Bir nanopmaddenin spektral profilinin belirlenmesi için bir yöntem, her dalga boyu parçacık karşıtlığı hesaplayarak,11,13,14,15aşağıdaki denklemin kullanarak:
Alternatif olarak, tek bir parçacık spektrumunun, DıC ‘nin iki polarizasyon alanını temsil eden, bireysel maksimum ve minimum sinyal bileşenlerine ayrılabilir, böylece iki eşzamanlı olarak toplanan yön bağımlı spektrumları görüntüler, iki denklem aracılığıyla:
Protocol
Representative Results
Discussion
DıC mikroskobu ile görüntüleme yapılırken, veri toplamadan önce optik bileşenleri optimize etmek önemlidir. Bir denemenin ortasında polarizatör için küçük ayarlamalar bile son verilere önemli etkilere neden olabilir6. Dahası, farklı malzemeler farklı polarize ayarları gerektirir. Polarizasyon açısının etkisini göstermek için burada büyük adım boyutları kullanılsa da, gerçek bir deneyde, en uygun kontrast ayarının 1 ° – 2 ° içinde polarize ayarını optimize e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Anthony S. Stender Ohio Üniversitesi ‘nde Nanoscale ve kuantum fenomen Enstitüsü (NQPı) aracılığıyla teknik destek kabul etmek istiyor. Bu makale, Ohio Üniversitesi tarafından Dr. Stender ‘a sağlanan başlangıç finansmanı ile mümkün hale gelmiştir.
Materials
| Contrad 70 | Decon Labs, Inc. | 1002 | For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers |
| Ethanol | Fisher Scientific | A962-4 | For cleaning and storing microscope glass |
| Glass microscope cover slips | Ted Pella | 260148 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26007 | |
| Gold nanorods | Nanopartz | DIAM-SPR-25-650 | |
| Gold nanospheres (80 nm) | Sigma Aldrich | 742023-25ML | |
| ImageJ | NIH | N/A | Free Software availabe for data analysis from NIJ |
| Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | N/A | |
| Nitrogen gas | Airgas | N/A | |
| ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera | Hamamatsu | 77054098 | |
| Scribing pen | Amazon | N/A | Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version. |
| Ultrapure water | 18 megaohm |
Riferimenti
- Pluta, M. Ch 7: Differential Interference Contrast in. Advanced Light Microscopy. 2, 146-197 (1989).
- Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response. ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).
- Stender, A. S., et al. Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy. Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).
- Mehta, S. B., Sheppard, C. J. R. Partially coherent image formation in differential interference contrast (DIC) microscope. Optics Express. 16 (24), 19462-19479 (2008).
- Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 1: Fundamentals of Light Microscopy. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second edition. , 1-20 (2012).
- Stender, A. S., Augspurger, A. E., Wang, G., Fang, N. Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy. Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).
- Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Mulvaney, P. Not All That’s Gold Does Glitter. MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).
- Maier, S. A. . Plasmonics: Fundamentals and Applications. , (2007).
- Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells. Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).
- Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).
- Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles. Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).
- Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 2: Light and Color. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , 21-33 (2012).
- Wayne, R. Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light. Light and Video Microscopy (Second Edition). , 43-78 (2014).
- Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries. The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).
- Hu, M., et al. Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance. Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).
- Choo, P., et al. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).
- Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries. Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).
