Analys av hjärtats kammare utveckling under musen embryogenes använder hela Mount Epifluorescence
Summary
Vi presenterar de protokoll för att undersöka mus hjärtat utveckling med hela mount epifluorescerande mikroskopi på musembryon dissekeras från ventrikulära specifika MLC-2v-tdTomato reporter inpressning möss. Denna metod tillåter oss att direkt visualisera varje skede av ventrikulära bildandet under musen hjärtat utveckling utan arbetsintensiva histochemical metoder.
Abstract
Målet med detta protokoll är att beskriva en metod för dissektion av musembryon och visualisering av embryonala mus ventrikulära kammare under hjärtat utveckling med hjälp av ventrikulära specifika fluorescerande reporter inpressning möss (MLC-2v-tdTomato möss). Hjärta utveckling innebär en linjär hjärtat tube formation, hjärtat röret looping och fyra kammare septation. Dessa komplexa processer är mycket bevarad i alla ryggradsdjur. Mus embryonala hjärtat har använts för hjärtat utvecklande studier. Det är dock allt tekniskt utmanande på grund av extremt små att dissekera mus embryonala hjärtan. Dessutom måste visualisering av hjärtats kammare bildas ofta in situ hybridisering, beta-galaktosidas färgning med Lindholm reporter möss eller immunfärgning av sektionerad embryonala hjärtan. Här beskriver vi hur dissekera mus embryonala hjärtan och direkt visualisera ventrikulära kammare bildandet av MLC-2v-tdTomato möss använder hela mount epifluorescerande mikroskopi. Med den här metoden är det möjligt att direkt undersöka hjärtat tube bildandet och looping och fyra kammare bildandet utan ytterligare experimentella manipulation av musembryon. Även om raden MLC-2v-tdTomato reporter inpressning musen används i detta protokoll som ett exempel, kan detta protokoll tillämpas på andra hjärta-specifika fluorescerande reporter transgena möss linjer.
Introduction
Kammaren bildandet under hjärtat utveckling är en komplex process som övergår genom flera morfologiskt skilda embryonala stadier1,2. Halvmåne formen av hjärt stamceller befolkningen bildar en linjär hjärtat rör och genomgår därefter töjning och repetition för att bilda formen spiral av utveckla hjärtat. Efter dess septation process förvandlas utveckla hjärtat till det fyrkamrat hjärtat. Avbrott i någon av dessa processer resulterar i utvecklingsmässiga hjärtfel. Det är således viktigt att förstå de molekylära mekanismerna bakom kammare bildandet under hjärtat utveckling. Trots många tidigare studier på hjärtat utveckling fortfarande vår förståelse av denna komplexa process begränsade.
In situ hybridisering, immunohistokemi och beta-galaktosidas färgning med Lindholm reporter möss har använts att studera kammare bildandet under musen hjärtat utveckling genom märkning hjärt specifika eller kammare specifika strukturella gener eller proteiner (t.ex. Nppa, kupp-TFII, Irx4, MLC-2a och MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Men dessa experiment med musembryon kräver betydande tid och expertis, eftersom flera olika experimentella steg måste utföras sekventiellt11. Här, beskriver vi en enkel hela mount epifluorescerande mikroskopi metod för att visualisera utveckla ventriklarna embryon dissekeras från MLC-2v-tdTomato reporter inpressning möss12. Fördelen med denna metod jämfört med tidigare använda metoder är att undvika komplexa experimentella steg som ofta kan skapa experimentella varianter. Det huvudsakliga syftet med detta protokoll är att beskriva hur dissekera musembryon och utveckla hjärtan och undersöka varje utvecklingsstadium mus hjärtats kammare utan tråkiga histochemical experiment. Denna metod som lätt kan tillämpas för att bedöma hjärtat utveckling med hjälp av olika andra transgena möss linjer märkning tidiga kardiella markörer (t.ex. Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-andra15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, och TgMef2c-AHF-GFP16 möss).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs här är relativt enkelt att undersöka ventrikulära kammare utveckling, utan att utföra arbetsintensiva experiment för att märka ventrikulära eller hjärt-specifika strukturella gener eller proteiner. Således, denna metod minimerar tekniska variabilitet som ofta finns i immunostained hjärta sektioner.
Det finns två kritiska steg för att framgångsrikt utföra denna metod inklusive exakt uppskattning av de embryonala åldern av möss och dissektion i embryonala …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH R03 HL140264 (Y.-J. (N) och Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. (N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
Riferimenti
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O’Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O’Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
