Kromogent in situ hybridisering SS ett verktyg för HPV-relaterade huvud och hals cancer diagnos
Summary
Humant papillom virus (HPV) RNA-kromogent in situ hybridisering anses vara en av de gyllene normerna för aktiv humant papillom virus infektion detektion inom tumörer. Det möjliggör visualisering av HPV E6-E7 mRNA uttryck med lokalisering och semikvantitativ utvärdering av dess signal.
Abstract
Infektion med humant papillom virus (HPV) är en stor riskfaktor för en subtyp av orofaryngeal skivepitelcancer (OPSCC), som tenderar att associeras med ett bättre resultat än alkohol-och tobaksrelaterade OPSCC. Kromogent in situ hybridisering (CISH) av HPV viral RNA kan möjliggöra semikvantitativ utvärdering av virus avskrifter av de onkogena proteiner E6 och E7 och en in situ visualisering med en god rumslig upplösning. Denna teknik gör det möjligt att diagnostisera en aktiv infektion med visualisering av HPV-transkription i de tumoral HPV-infekterade cellerna. En fördel med denna teknik är att undvika kontaminering från nonneoplastiska HPV-infekterade celler i anslutning till tumören. Sammantaget, dess goda diagnos föreställningar har det anses vara den gyllene standarden för aktiv HPV-infektion identifiering. Eftersom E6 och E7 viral protein interaktion med cell proteiner pRb och p53 är obligatoriskt för cell Transformation, HPV RNA CISH är funktionellt relevant och akut återspeglar aktiv onkogen HPV-infektion. Denna teknik är kliniskt relevant liksom eftersom “låg” eller “hög” HPV transkription nivåer hjälpte identifiering av två prognos grupper bland HPV-relaterade P16-positiva huvud-och hals cancer patienter. Här presenterar vi protokollet för manuell HPV RNA CISH utförs på formmalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) dia bilder med ett kit som erhållits från tillverkaren. Istället för kromogen uppenbarelse kan RNA i situ hybridisering också utföras med fluorescerande uppenbarelse (RNA FISH). Det kan också kombineras med konventionell immunofärgning.
Introduction
HPV RNA CISH är ett kraftfullt verktyg för detektion av aktiv HPV-infektion, vilket kan visa sig avgörande i godartade eller maligna lesioner på olika platser såsom orofarynx eller livmoder halsen. Upptäckten av en aktiv HPV-infektion kan stödja diagnosen av en HPV-inducerad lesion och därmed påverka dess behandling och prognos.
HPV är den vanligast förekommande sexuellt överförbara infektionen, och över 100 viral genotyper har beskrivits1. Schematiskt, låg risk genotyper såsom genotyper 6 och 11 är kända för att inducera genitala vårtor, recidiverande respiratorisk papillomatos, och andra godartade lesioner, medan högrisk genotyper såsom genotyper 16 och även 18 är ansvariga för de flesta livmoder hals cancer och anal cancer och spela en roll i HNSCC onkogenes i varierande proportioner som redovisas av regionala epidemiologiska data2.
Det finns flera verktyg för detektion av HPV-infektion. Eftersom en högrisk-HPV-infektion leder till ett uttryck för viral onkogena proteiner E6 och E73, är upptäckten av E6 och E7 transkriptioner allmänt ses som den gyllene standarden för aktiv HPV-infektion identifiering4. HPV RNA CISH kan utföras på FFPE prover som är ganska lätt erhålls från patienter som lider av olika HPV-relaterade sjukdomar. Dess prestanda har utvärderats i skivepitelcancer intraepitelial neoplasi i livmoder halsen, anus, och slidan, och i invasiv skivepitelcancer i livmoder halsen, anus, och den övre aeromag-tarmkanalen5: det uppnår en känslighet på över 98% av HPV DNA-polymeras kedje reaktion (PCR)-positiva fall. Detta är något bättre än P16 immunofärgning (93%) och HPV DNA in situ hybridisering (DNA ISH: 97%), som är mer vanligt förekommande. I en annan kohort av 57 patienter med skivepitelcancer (SCC) som uppkommer från huvud-och hals regionen, underlivet, huden och urinvägarna, jämfört med HPV DNA ISH, uppnådde HPV RNA CISH bättre känslighet (100% mot 88%) och specificitet (87% jämfört med 74%)6.
P16 immunofärgning är en indirekt markör reflekterande cell cykel störningar som kan orsakas (men inte uteslutande) av HPV-infektion4,7. Detta kostnads effektiva test besitter god känslighet och ett negativt prediktivt värde och rekommenderas som en surrogat markör för högrisk-HPV-infektion i orofarynxcancer (OPC) av College of American patologer (CAP) och av unionen för internationella Cancer Control (UICC)8.
Även om detta papper fokuserar enbart på detektion av HPV i HNSCC, HPV RNA CISH är kliniskt relevant i olika andra tillstånd som involverar HPV-infektion. Till exempel, denna teknik kan förbättra noggrannheten av diagnosen låggradig skivepitelcancer intraepiteliala lesioner i livmoder halsen (LSIL, tidigare känd som cervikal intraepitelial neoplasi, grad 1 [CIN1]) för morfologiskt tvetydiga fall9. När det gäller orofaryngeal SCC, HPV RNA CISH möjliggör identifiering av HPV-relaterad SCC, märkt som skiljer sig från HPV-relaterade orofaryngeal SCC i den senaste åttonde upplagan av TNM klassificering av huvud-och hals cancer (i unionen för internationella cancer Kontroll [UICC])10. Eftersom HPV-relaterad SCC uppvisar en bättre prognos med längre överlevnad och förbättrad strål behandling och kemoterapi känslighet än HPV-obesläktad SCC11,12,13, kan detektion av HPV-infektion påverka patient hantering14,15. Dessutom kan HPV RNA CISH användas för diagnosticering av HPV-relaterad multifenotypisk sinonasal cancer med en högre signal än HPV-DNA CISH16. Flera multivariat analyser tyder på att detektion av E6-och E7-transkriptioner är korrelerad med en bättre prognos i orofaryngeal SCC totalt7,15,17,18 och i subgrupp av P16-positiva orofaryngeal SCC19,20.
Här presenterar vi protokollet för manuell HPV RNA CISH utförs på FFPE dia bilder med ett kit som erhållits från tillverkaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
HPV RNA CISH utförs med ett köpt kit är ett kraftfullt verktyg för att upptäcka virus avskrifter och det tyder på aktiv HPV-infektion. Utförs manuellt, stegen i protokollet är övergripande lätt att följa, och det köpta kit är bekvämt. Denna teknik tillåter färgning av 19 histologiska prover plus en kontroll bild på en gång, och analysen varar runt 8 h. Det är viktigt att inte låta proverna torka ut mellan stegen om inte annat anges. Förbehandlings tillståndet kan behöva justeras beroende på den ma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Institutionen för patologi Hopital européen Georges Pompidou och Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel och Gisèle legall); Histologiplattformen av PARCC, Hopital européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark för språk redigering; Alexandra Elbakyan för hennes bidrag.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
Riferimenti
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Ricerca sul cancro. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
