Обработка бронхоальвеолярной жидкости и совмещенных крови для альвеолярного макрофага и CD4- Т-клеточного иммунофенотипирования и оценки водохранилища ВИЧ

Summary

Мы описываем метод обработки бронхоальвеолярной жидкости для лаважа и соответствующей периферической крови хронически ВИЧ-инфицированных лиц на антиретровирусной терапии для оценки легочных резервуаров ВИЧ. Эти методы приводят к приобретению высокочистых CD4 Т-клеток и альвеолярных макрофагов, которые впоследствии могут быть использованы для иммунофенотипирования и количественных показателей ДНК/РНК с помощью сверхчувствительной полимеразной цепной реакции.

Abstract

Бронхоскопия является медицинской процедурой, в которой нормальный сосуд вводится в легкие через бронхоскоп, а затем всасывание применяется, удаление бронхоальвеолярной лавыни (BAL) жидкости. BAL жидкости богата клетками и, таким образом, может обеспечить “снимок” легочной иммунной среды. CD4 Т-клетки являются наиболее характеризуемыми резервуарами ВИЧ, в то время как есть веские доказательства того, что макрофаги тканей, в том числе альвеолярные макрофаги (AMs), также служат в качестве вирусных резервуаров. Тем не менее, многое еще неизвестно о роли AMs в контексте создания и поддержания резервуаров ВИЧ. Таким образом, разработка протокола для обработки жидкости BAL для получения клеток, которые могут быть использованы в вирусологических и иммунологических анализов для характеристики и оценки популяций клеток и подмножеств в легких имеет отношение к пониманию роли легких, как ВИЧ Водохранилищ. Здесь мы описываем такой протокол, используя стандартные методы, такие как простая центрифугация и цитометрия потока. CD4 Т-клеток и AMs могут быть использованы для последующего применения, в том числе иммунофенотипирования и ВИЧ ДНК и РНК количественной оценки.

Introduction

Одной из наиболее значительных проблем, стоящих перед лекарством от ВИЧ-инфекции, является наличие скрытого резервуара ВИЧ, который вызывает отскок плазменной виремии после прерывания антиретровирусной терапии (АРТ)^1,2. В то время как резервуар ВИЧ во время длительной АРТ хорошо документирован в нескольких отделениях тканей, включая вторичные лимфоидные органы, связанную с кишечником лимфоидную ткань (GALT) и центральную нервную систему (ЦНС), легкие были упущены из виду как область исследования с эпохи до АРТ³. Однако легкие играют центральную роль в патогенезах ВИЧ. Действительно, легочные симптомы были одними из первых показателей связанных со СПИДом оппортунистических инфекций⁴. Даже в современную эпоху АРТ люди с ВИЧ подвергаются большему риску развития как инфекционных, так и неинфекционных заболеваний легких, чем лица без ВИЧ. Например, лица с ВИЧ-инфекцией подвергаются повышенному риску развития инвазивной стрептококковой пневмонии, а также хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ)^5,6. Кроме того, коинфекция туберкулеза (ТБ) и ВИЧ является серьезной проблемой общественного здравоохранения в некоторых регионах мира, в частности в странахАфрики к югу от Сахары, поскольку вероятность заражения ВИЧ ВИЧ в 16-27 раз выше, чем у лиц, не имеющих ВИЧ-7. Хотя некоторые объяснения этой восприимчивости к легочной инфекции и хронических заболеваний были предложены^8,9,10, точные клеточные механизмы, с помощью которых люди с подавленным ВИЧ плазменной вирусной нагрузки остаются на более высокий риск легочных осложнений не были полностью выяснены. Важно отметить, что ВИЧ является очень сильным фактором риска легочной инфекции и хронических заболеваний, независимо от статуса курения^6.

Анализ иммунной среды легких, поэтому, имеет решающее значение для того, чтобы понять его роль в здоровье и болезни. Хотя неинвазивные, индуцированные образцы грядки, как правило, содержат большое количество эпителиальных клеток и мусора с редкими легочными лимфоцитами и без АМ, ограничивая их роль конкретными приложениями. И наоборот, крупные биопсии тканей не могут быть получены при отсутствии подозрений на заболевание из-за связанных с этим рисков значительного кровотечения и пневмоторакса (коллапса легких). Кроме того, большинство легочных иммунных клеток в основном расположены на уровне слизистой оболочки, где легкие постоянно стимулируются антигенами во время дыхания. С этой целью бронхоскопия для получения жидкости BAL имеет то преимущество, что обеспечивает относительно безопасный доступ к лимфоцитам и АМ (см. рисунок1). Макрофаги составляют наибольшую долю клеток в жидкости BAL, за которыми следуют лимфоциты^11. Поэтому полезно создать метод, с помощью которого жидкость BAL может быть обработана для использования в последующих приложениях, таких как иммунофенотипирование, клеточная культура, транскриптомика или любые дальнейшие применения. Протокол для обработки жидкости BAL, изложенные здесь, адаптирован из общих процедур, описанных ранее и оптимизированных для различных анализов вниз по течению. Эта методология позволяет проводить изоляцию как легочных лимфоидных, так и миелоидных слизистой иммунных клеток для их фенотипической и функциональной характеристики, а также оценку резервуара ВИЧ у взрослых, живущих с ВИЧ.

Для установления этого протокола мы использовали следующие критерии для набора участников исследования¹⁵. Для того чтобы участники имели право участвовать в этом исследовании, они должны были быть ВИЧ-инфицированными лицами, которые отвечали следующим критериям: (1) по АРТ в течение по крайней мере 3 лет; (2) подавленная вирусная нагрузка (VL) в течение как минимум 3 лет; (3) количество клеток CD4 T вразмере 200/мм 3; (4) готовы пройти исследования спирометрии и бронхоскопии. Пациенты со следующими критериями были исключены из исследования: (1) противопоказание (ы) к бронхоскопии; (2) высокий риск кровотечения: коагулопатия или на варфарин или клопидогрел терапии; (3) тромбоцитопения (низкие тромбоциты); (4) активная легочная инфекция или другой острый пульмонный процесс; (5) беременная/пытаясь забеременеть.

Protocol

Этот протокол исследований был создан непосредственно на основе принципов, включенных в Хельсинкскую декларацию, и получил одобрение институциональных наблюдательных советов Центра здоровья Университета Макгилла (RI-MUHC, #15-031), Университета Квебека Монреаль (УЗАМ, #602) и Центр речерче дю Центр Hospitalier де l’Университет Монреаля (CR-CHUM, #15-180). 1. Бронхоальвеолярная лаваж ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел описывает бронхоскопию в исполнении лицензированного респираторного врача с помощью респираторного терапевта16,17. Подготовьте части аппарата, необходимые для процедуры, в том числе бронхоскоп и солин. Управляй анестезируетсиком в задней части горла пациента. Избегайте чрезмерного использования местной анестезии, когда это возможно. Применение сердечного приводит к груди для того, чтобы контролировать частоту сердечных приступов и ритма и кислородный зонд к первому пальцу руки для того, чтобы контролировать насыщение кислородом. Вставьте носовой канюли в ноздри, чтобы обеспечить дополнительный кислород. Позиционировать пациента, желательно в положении на спине. Администрирование седации следующим образом: мидазолам 0,01-0,04 мг/кг и фентанил 50-100 мкг (для облегчения комфорта пациента и минимизации рефлекса кашля) внутривенно, в присутствии респиратора или анестезиолога. Продвигайте гибкий бронхоскоп до тех пор, пока он не заклинит в желаемый подсегментальный бронхов. Привить солен (50-60 мл за один раз) со шприцем, а затем нанесите нежный всасывание (50-80 мм рт. с. Промывка жидкости будет собирать в шприц, а затем быть переданы в контейнер для сбора. Повторите флеш в общей сложности 200-300 мл промывки. Соберите не менее 100 мл жидкости BAL, если это возможно. Поместите жидкость BAL на лед. 2. Изоляция BAL-клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура должна проводиться в стерильных условиях в шкафу биологической безопасности, класс II (BSL2) или выше. Храните образцы BAL на льду до тех пор, пока они не будут обработаны. Vortex BAL в оригинальной трубке сбора и передать его в 50 мл трубки с помощью серологического пипетки. Если жидкость BAL выглядит очень мутной или загрязненной нитевидной тканью, процедите жидкость через нейлоновый фильтр в 70 м/м в новую трубку мощностью 50 мл. Центрифуга при 200 х г в течение 10 мин при 4 градусах По цельсию. Перенесите супернатант на новую трубку 50 мл. Аккуратно разбейте гранулы наконечником пипетки и отрежь его в 1 мл среды RPMI 1640. Передача 1 мл супернатанта на каждую из 10х 1,5 мл микроцентрифуговых труб и оставшиеся супернатанты в 15 мл труб, по 10 мл в каждом. Храните все супернатантные трубки при -80 градусах Цельсия. Обработайте гранулы BAL. Отрежь гранулу в 10 мл RPMI 1640 на каждые 25 мл первоначального образца. Центрифуга при 200 х г в течение 10 мин при 4 градусах По цельсию. Перенесите супернатант в новую трубку 15 мл (отбросьте после обеспечения достаточного количества клеток в гранулах). Приготовь гранулы в 1 мл RPMI 1640 и 10% сыворотки для крупного рогатого скота (FBS) и подсчитайте с помощью трипан синего и гемоцитометра.ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкость BAL не отделяется присоединением клеток перед сортировкой, перейдите к разделу 4. 3. Соблюдение BAL клеток (необязательно) ПРИМЕЧАНИЕ: Этот альтернативный протокол может быть выполнен до или вместо сортировки ячеек. Следующая процедура должна проводиться в стерильных условиях в шкафу BSL2 (или выше). Перенесите нужное количество BAL-клеток для сортировки на новую трубку 15 мл и составьте правильный объем для 1,5 х 106 макрофагов/мл. Плита 2 мл клеток на хорошо в 6-колодцев и инкубировать на 2 ч при 37 градусов по Цельсию с 5 % CO2, чтобы дать время для присоединения. После инкубации тщательно аспирируйте носители, содержащие непридерживаемые клетки, и перенесите их в трубку 15 мл. Центрифуга при температуре 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). Удалите супернатант и повторно на 1 х 107 клеток / мл в фосфат-буферных солен (PBS) 2% FBS и передать подвеску на 5 мл с круглым дном полистирола трубки. Эта фракция лимфоцитов теперь готова к окрашиванию клеток. К остальным клеткам адептов в пластине добавьте 1 мл на скважину раствора клеточной дисассоциации (см. Таблицу Материалов) и инкубацию в течение по крайней мере 15 мин при 37 градусах Цельсия с 5% CO2,пока клетки легко не отделяются от пластины с наконечником пипетки. Аккуратно, но тщательно соскребите клетки адепта с поверхности колодца с помощью наконечника пипетки и используйте 1 мл жидкости в колодце, чтобы помочь с отслоением. Перенесите клетки в новую трубку 15 мл. Вымойте скважины с 1 мл PBS и добавить это в той же трубке. Составьте содержание трубки до 5 мл с ПОМОЩЬю PBS. Центрифуга на 300 х г в течение 10 мин на RT. Удалите супернатант, resuspend на 1 х 107 ячеек/мл PBS и 2% FBS, и передать подвеску на 5 мл с круглым дном полистирола трубки. Эта миелоидная фракция теперь готова к окрашиванию клеточной сортировки. 4. Изоляция моноядерных клеток периферической крови ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура должна проводиться в стерильных условиях в шкафу BSL2 (или выше). В тот же день бронхоскопии (как правило, непосредственно перед коллекцией BAL), получить шесть труб венозной крови от донора в этиленедиаминетететраацетической кислоты (ЭДТА) трубки (примерно 10 мл на трубку). Разделите кровь путем центрифугации трубок крови на 300 х г в течение 15 мин на RT. Перенесите плазму в микроцентрифугные трубки 1,5 мл в 1 мл aliquots и храните ее при -80 градусов по Цельсию. Выполните разделение градиента плотности. Добавьте 2 мл RPMI 1640 к каждой трубке крови и хорошо перемешайте с помощью серологического пипетки. Перенесите на трубы 3x 50 мл и составьте объем в каждой трубе до 25 мл с RPMI 1640. Подготовьте еще одну партию труб 3x 50 мл, каждая из которых содержит 20 мл лимфоцитов сепаратной среды (LSM) (см. Таблицаматериалов) на RT. Медленно и мягко слой 25 мл разбавленной крови на верхней части LSM для каждой из трех труб, держа трубку под углом 45 ” . Центрифуга при 600 х г в течение 25 мин при РТ с низким ускорением и без замедления (торможение). Выполните промывку периферических моноядерных клеток крови (ПБМК). Перенос слоя клеток на стыке двух жидких фаз в трубке в трубку 50 мл с помощью серологического пипетка; если объем превышает 30 мл, разделите его на две трубки. Составьте объем в каждой трубке до 50 мл с ПОМОЩЬю PBS. Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин на RT и удалить как можно больше супернатанта, как это возможно. Приостановите гранулы и составьте объем до 25 мл с помощью PBS. Центрифуга на 350 х г в течение 10 минут на RT и удалить как можно больше супернатанта, как это возможно. Повторите шаг стирки, описанный в шаге 4.4.3. Приготовь гранулы в 5 мл PBS и 2% FBS и подсчитайте клетки. 5. Сортировка целых BAL ячеек и ПБМК ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура должна проводиться в стерильных условиях в BSL2 (или выше). Подготовьте сортировку буфера, содержащего PBS 5% FBS и 25 мМ HEPES (pH 7.4). Приготовьте 5 мл полистироновых трубок с 1 мл FBS для сбора отсортированных подмножеств клеток. Выполните окрашивание. Подготовка 3x 5 мл круглых дном полистирола трубки, каждый для BAL (целые клетки или лимфоцитов и миелоидных фракций после присоединения) и ПБМК (см. раздел 4). Для каждого подмноза, подготовить одну трубку с клетками для сортировки и две трубки 5 х 105 клеток, чтобы использовать для неокрашенных и жизнеспособности пятно компенсации контроля. Центрифуга при 350 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Удалите супернационты, повторно приостановите работу ячеек для контроля в 100 КЛ PBS и храните их при 4 градусах По Цельсию до тех пор, пока контроль за компенсацией не будет подготовлен так, как описано в шаге 5.2.6. Подготовьте 1:20 разбавления fc рецепторов (FcR) блокирующий реагент в PBS 5% FBS (см. Таблицуматериалов,чтобы предотвратить неспецифическую связывание антитела к FcR на FcR-выражающих клетки). Приостановите их сортировку на 1 х 107 ячеек в 250 Зл из fcR-блокирующей смеси. Инкубировать их в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия. После инкубации добавьте соответствующий коктейль из антител (см. таблицу 1) в клетки и насижайте по 1 ч при 4 градусах Цельсия в темноте. После 1 ч окрашивания, добавить 1 мл PBS в клетки и центрифуги на 350 х г в течение 5 минут при 4 C. Удалите супернатант и повторное действие ячеек в сортировке буфера, чтобы иметь 1 х 107 ячеек в 250 Л. Фильтр клетки через 70 мкм фильтр, если это необходимо. Подготовьте контроль за компенсацией. Добавьте по три капли каждой из антимыков ig, и отрицательной контрольной компенсации шариков (см. ТаблицуМатериалов) на 1 мл PBS в микроцентрифуговой трубке и перенесите 100 л на каждую 5 мл круглого дна полистирола трубки, которые будут использоваться для компенсации. Подготовьте одну трубку для каждого флюорохрома, присутствующем в коктейле, который будет использоваться. Добавьте 1 зл каждого антитела в коктейль в другую трубку, содержащую бусы. Добавьте 1 зЛ пятна жизнеспособности к одной из труб 5 х 105 5 клеток, отведенных в шаге 5.2.1. Инкубировать в течение 20 минут при 4 градусах по Цельсию в темноте. Добавьте 1 мл PBS к каждой трубке и центрифуге при 350 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсии. Удалите супернатант и resuspend гранулы в 250 Зл Л PBS. Хранить при 4 градусах по Цельсию в темноте до необходимости. Сортируйте клетки с помощью флуоресценции активированных клеток сортировки (FACS) в сбор трубки подготовлены с 1 мл FBS и вихрь осторожно, чтобы покрыть стороны труб с сывороткой. Сортировать BAL клетки при низком давлении. Клетки ворот сперва для того чтобы исключить шум и вклюать в реальном маштабе времени, клетки CD45, и внутри это gate населенности вне клетки дублета (см. Рисунок 3). В пределах более большой миелоидной населенности сортируют CD206 и CD169 двойные положительные клетки как AMs; в пределах меньшего населения лимфоцитов изолировать клетки CD3и сортировать как CD4 и CD8 одной положительной популяции (см. Рисунок 3; gating стратегия подробно описана в разделе репрезентативных результатов). При сортировке PBMCs, ворота клетки сначала исключить шум и включают жить, CD45и клетки, и в этой популяции ворота из двойных ячеек. Далее, ворота на клетках CD3 и в CD3- население, ворота сначала на CD14 и сортировать одноположительные моноциты, а затем в пределах CD3- демографические ворота на CD4 и CD8 и сортировать как одиночные положительные популяции (стратегия gating, описанная в Раздел «Результаты представительи». 6. Иммунофенотипирование AMs и ПБМК ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура должна проводиться в стерильных условиях в шкафу BSL2 (или выше). Добавьте до 1 миллиона каждый из AMs и PBMCs к двум отдельным 5 мл круглого дна полистирола труб. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах по Цельсию и удалите супернатант. Выполните fcR блокировки для улучшения специфики окрашивания антител. Для этого, resuspend клетки в 100 QL PBS 2% FBS и добавить 1,4 зл и l fcR блокирующий реагент. Инкубировать в течение 20 мин при 4 oC. Выполните внеклеточное окрашивание. После инкубации с блоком FcR, добавить желаемый внеклеточный коктейль антитела, вихрь труб, и инкубировать в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия в темноте. Вымойте 2x, добавив 500 л ПБС и центрифуги при 350 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсии. Подготовка к фиксации и пермяки (см. Таблицу материалов для конкретных реагентов, используемых). Подготовьте решение permeabilization с буфером permeabilization 1 части и буфером разбавителя 3 частей. Приостановите гранулы в 1 мл раствора пермяки и инкубировать в течение 40 минут при 4 градусах Цельсия в темноте. Подготовка мытьраствор с помощью 1 часть мытья буфера и 4 части H2O. Добавить 2 мл раствора для мытья в пермяковые клетки и центрифуги на 350 х г в течение 5 мин при 4 c. Удалите супернатант. Выполните внутриклеточное окрашивание. Приостановите работу клеток в 100 л раствора для мытья 1x, добавьте нужные внутриклеточные антитела, вихрь трубок и инкубируют не менее 1 ч при 4 градусах По Цельсию в темноте. Добавьте 2 мл раствора для мытья и центрифугу при 350 х г в течение 5 мин на РТ. Удалите супернатант и приостановите гранулы в 200 ЛЛ PBS. Храните ячейки при 4 градусах по Цельсию в темноте до тех пор, пока это не понадобится. 7. Остаток BAL-клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура должна проводиться в стерильных условиях в шкафу BSL2 (или выше). Номера клеток позволяет, криоконсервные живые клетки из pellet клетки BAL (от шага 2.2.2). Подготовка заморозить средства массовой информации, содержащие 90% FBS и 10% диметил сульфодоксид (DMSO). Центрифуги клетки на 300 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант и повторно в 1,5 мл замораживания средств в криогенный флакон. Перенесите криогенные флаконы в контейнер для замораживания с контролируемой скоростью (см. таблицуматериалов) и поместите их на уровне -80 градусов по Цельсию. Передача клеток в жидкий азот для длительного хранения после достижения температуры. Сохранить BAL клеток, как сухие гранулы. Перенесите оставшиеся клетки в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Центрифуга в контр-топ центрифуги на 6000 х г в течение 1 мин. Удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулы. Храните гранулы при -80 градусах Цельсия. 8. Количественная оценка ДНК и РНК ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура должна проводиться в стерильных условиях в шкафу BSL2 (или выше). Общая количественная оценка ДНК ВИЧ Чтобы избежать ингибирования полимеразы цепной реакции (ПЦР) с BAL lysate мусора, использовать набор для извлечения ДНК (см. таблицу материалов) для извлечения ДНК из образца BAL клеток в соответствии с инструкциями производителя. Используйте 15 кл этой ДНК в сочетании с мастер-миксом в описанном ниже шаге предамплификации (шаг 8.1.3). Подготовка стандартных разбавлений кривой. Как указано выше, используйте набор для извлечения ДНК из гранул 2 х 106 клеток ACH-2 (см. таблицуматериалов). После утилизаЦИи ДНК, выполнять серийные 10-раз разбавления ДНК ACH-2 для создания шести разбавления, начиная от 3 х 105 клеток до 3 клеток на 15 ЗЛ. Выполните шаг предамации. В отдельной комнате, подготовить мастер-микс для n 2 образцов, состоящий из 1x полимераза буфера, 3 мМ MgCl2, 300 мкм dNTPs, и 2,5 U Из Так ДНК полимераза (см. Таблица материалов) и 300 нм каждого из четырех грунтовок (см. шаг 8.1.3.2). Выполняйте все меры в тройных скважинах. Используйте праймеры hCD3OUT5′, hCD3OUT3′, ULF1 и UR1 для генерации усиленной ДНК как от CD3 человека, так и от ВИЧ (см. последовательности в таблице2). Обратите внимание, что оба гена предварительно амплифицируются в одной трубке. Смешайте осторожно и вращаться вниз трубки для обеспечения полного смешивания. Распределите 35 зЛ мастерской смеси на скважину в 96-хорошей пЦР пластине и добавьте 15 зл стандартной или образец ДНК. Общий объем реакции составляет 50 л. Выполните преамплификацию (денатурация при 95 градусах по Цельсию в течение 8 мин, затем 12 циклов по 95 градусов по Цельсию в течение 1 мин, 55 градусов по Цельсию в течение 40 с, 72 кв.м. в течение 1 мин и удлинение при 72 градусах по Цельсию в течение 15 мин). Выполняйте ПЦР в режиме реального времени. Для количественной оценки ДНК CD3 и ВИЧ подготовьте два мастер-микса, содержащих мастер-микс реакции 1x PcR (см. таблицуматериалов), 1250 нм соответствующих грунтовок и 100 нм зонда. Используйте праймеры HCD3IN5′ и HCD3IN3′ и зонд CD3 Fam”, чтобы количественно человека CD3 в одной реакции, и праймеры UR2 и LambdaT и зонд UHIV Fam’ene для количественной оценки ДНК ВИЧ в другой реакции (см. последовательности в таблице 2). Распределите 13,6 л каждой смеси в трубках, адаптированных к qPCR. Разбавить преусилитель ПЦР продукт в 1:10 в стерильной воде, DNase, RNase, и протеазы бесплатно. Добавьте 6,4 л каждой разбавленной выборки к 13,6 л смеси qPCR в qPCR-адаптированных трубках при общем объеме реакции 20 зл. Выполняйте ПЦР в реальном времени, используя следующую программу: денатурация при 95 градусах по Цельсию в течение 4 мин и 40 циклов 95 градусов по Цельсию для 3 с и 60 градусов по Цельсию для 10 с с одним приобретением. Экстраполировать количество копий ВИЧ и эквивалентов числа клеток в каждой реакционной трубке из стандартных кривых. Рассчитайте количество копий ДНК ВИЧ/106 клеток. Количественная оценка РНК ВИЧ Извлекайте РНК из образца клеток BAL, используя комплект экстракции РНК (см. таблицуматериалов) в соответствии с инструкциями производителя. Используйте 17 qL этой РНК в обратном этапе транскрипции и предамплификации, описанном ниже (шаг 8.2.4). LTR-gag РНК синтезируется в пробирке и точно количественно используется в качестве стандарта; он шипами в здоровый экстракт РНК донора для нормализации GUSB. Подготовьте шесть серийных 10-кратных разбавлений этого стандарта, соответствующих 3 х 105 ячеек до трех копий LTR-gag РНК в 17 Л. Распределите 17 qL каждого стандартного разбавления и каждого образца в 96-хорошей пластине ПЦР и обработайте образцы DNase (см. таблицуматериалов) в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия для удаления загрязняющей геномной ДНК. Остановите реакцию, добавив 2 зЛ 25 мМ EDTA и инкубировать образцы в течение 10 минут при 65 градусах Цельсия. Выполните обратную транскрипцию (RT) и предусилительную ПЦР. Выполните этот шаг с помощью одноступенчатого комплекта RT-PCR (см. ТаблицуМатериалов) в соответствии с инструкциями производителя. Используйте праймеры GUSB вперед 1, GUSB обратный 1, UR1, и ULF1 для создания усиленной кДНК от обоих человеческих GUSB как домашнего гена и LTR-кляк ВИЧ РНК (см. последовательности в таблице 2). Значения GUSB будут использоваться для нормализации значений ВИЧ. Распределите 31 зЛ мастерской смеси на скважину в той же 96-хорошей пЦР пластине, содержащей стандарты и образцы, обработанные DNase, и хорошо перемешайте. Общий объем реакции составляет 50 л. Выполнить пластину в течение 16 циклов в соответствии с инструкциями производителя, с обезвоженной температурой 55 градусов по Цельсию. Выполняйте ПЦР в режиме реального времени. Подготовьте два мастер-микса, содержащего мастер-микс реакции 1x PcR (как указано выше в шаге 8.1.4.1), 1250 нм соответствующих грунтовок и 100 нм зонда. Используйте праймеры GUSB forward 2, GUSB reverse 2 и зонд GUSB-HEX для количественной оценки GUSB cDNA в одной реакции; использовать праймеры UR2, LambdaT и зонда UHIV Fam’ene для количественной оценки кДНК ВИЧ в другой реакции (см. последовательности в таблице2). Распределите 13,6 л каждой мастерской смеси в трубках, адаптированных к qPCR. Разбавить RT предусилитель пЧР продукты 1:10 в стерильной воде, DNase, RNase, и протеазы бесплатно, и добавить 6,4 л каждого разбавленного образца или стандарта в соответствующую смесь ПЦР. Общий объем реакции составляет 20 л. Выполните в режиме реального времени ПЦР с использованием следующей программы: денатурация при 95 градусах по Цельсию в течение 4 мин и 40 циклов 95 градусов по Цельсию для 3 с и 60 градусов по Цельсию для 10 с с одним приобретением (выберите зеленый канал для Фамзена и желтый для HEX).

Representative Results

У большинства некурящих жидкость BAL поступает в стерильный контейнер и представляет собой слегка мутную желто-оранжево-оранжевую жидкость. В жидкости может быть розовый цвет, если донор перенес эндобронхиальной биопсии во время бронхоскопии и некоторые кровотечения произошло. Если донором является курильщик, жидкость может быть более темного цвета. После центрифугации, BAL супернатант будет почти ясным и слегка оранжевым, в то время как клеточные гранулы могут варьироваться в цвете от белого до очень темно-коричневого, в зависимости от состояния образца и был ли донор курильщиком или нет. При подсчете всего образца BAL, различные типы клеток могут быть визуализированы, в том числе большие, круглые макрофаги около 17 мкм в диаметре и меньше круглых лимфоцитов около 7,3 мкм в диаметре18,19 (см. Рисунок 2). Макрофаги увеличены у курильщиков примерно на 40. Различие между типами клеток позволяет рассчитывать макрофаги и лимфоциты отдельно. Там также могут быть некоторые обломки видны в поле, особенно в образцах от курильщиков. Макрофаги являются наиболее распространенным типом клеток в BAL, на долю которых приходится около 85% клеток у некурящих20, и они обогащаются у курильщиков, поэтому они могут показаться почти эксклюзивными. КЛЕТКи BAL имеют тенденцию к агрегированию, поэтому они должны быть хорошо смешаны во время всех манипуляций. Гранулы могут казаться темными даже после нескольких шагов мытья. Если нитевидный мусор проявляется в фракции после окрашивания для сортировки клеток, пройти клетки через 70 мкм фильтр, прежде чем запустить их через сортировку ячейки. Сортировка BAL-клеток должна осуществляться под низким давлением, чтобы обеспечить размеры капель, достаточно большие для размещения макрофагов. Клетки сначала закрыты, чтобы включить все CD45и21 ячейки, а затем на основе жизнеспособности, чтобы обеспечить все мертвые клетки исключены (см. Рисунок 3). Singlet клетки затем выбрали и в рамках этого, две популяции закрыты на основе размера и морфологии, а именно большие миелоидные клетки и меньшие лимфоциты (см. Рисунок 3). В более крупных ячеек, клетки закрыты на CD20622,23 и CD16922 и двойные положительные клетки сортируются как AMs, в то время как в меньших ячеек, CD3- клетки выбираются и закрыты на CD4 и CD8; Сортируются одноположительные и cd8 одноположительные ячейки CD4 (см. рисунок3). Используемые маркеры были выбраны на основе ранее описанных фенотипов AMs, таких как рецептор маннозы CD206, найденный на фагоцитарных клетках23, и рецептор sialoadhesin CD16922. При сортировке ПБМК, клетки сначала закрыты на передний и боковой рассеяния, которые должны показать однородную популяцию лимфоцитов, все из которых взяты, исключая шум близко к нулевой оси (данные не показаны). Население закрыто на жизнеспособность и CD45, и живые клетки CD45 используются. Это население затем закрыто на CD3; чтобы изолировать моноциты, CD3- население впоследствии закрыто на CD14 и все одиночные положительные клетки сортируются. Чтобы изолировать подмножества лимфоцитов, клетки CD3и закрыты на CD4 и CD8 и как одиночные положительные и клеточные популяции сортируются. Рисунок 1 обзор протокола. Схема, показывающая рабочий процесс протокола, включая потенциальное использование сгенерированных образцов. PBMC – периферийные моноядерные клетки крови; БАЛ – бронхоальвеолярная лаваж; ЛСМ и среда разделения лимфоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2 : Микроскоп поле зрения всей жидкости BAL. Микроскоп изображения из (A) некурящий и (B) курильщик с видимыми лимфоцитами (L), макрофаги (M), и эритроцитов (РБК). Увеличение 1000x (10x глазной и 100x объектив с погружением масла). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3 : Представитель gating стратегии для сортировки клеток целых BAL ячеек. Стратегия Gating используется для сортировки альвеолярных макрофагов (AM), CD4 и CD8 T-клеток из целых образцов BAL-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Образец Антитела Фторхром Клон Объем на тест (КЛ) BAL и PBMC Live/Dead APC-H7 – 1 CD45 PE-Cy7 HI30 5 CD3 Alexa700 UCHT1 2 CD4 PE-cy5 РПА-Т4 4 CD8 BV605 SK1 3 BAL только CD206 Pe 19.2 10 Лет CD169 BB515 7-239 5 Только PBMC CD14 BV786 M5E2 5 Таблица 1: Панель потока для сортировки целых балков и изолированных ПБМК. Целевой Шаг Имя праймер Праймер Последовательность ВИЧ Всего ДНК или ВИЧ LTR-Gag РНК Предусилительация ПЦР UR1 5′-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3′ ULF1 5′-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTa GAC-3′ ПЦР в реальном времени UR2 5′-CTG AGG GAT CTC TAG TTa CC-3′ ЛамбдаТ 5′-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3′ УВИЧ Фамзен: 5′-/56-FAM/CA CTC AAG G/ЗЕН/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkF’/-3′ CD3 ДНК Предусилительация ПЦР HCD3 из 5′ 5′-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3′ HCD3 из 3′ 5′-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3′ ПЦР в реальном времени HCD3 в 5′ 5′-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3′ HCD 3 в 3′ 5′-CCT CTC TTC AGC CAT TTa AGT A-3′ CD3 Фамзен: 5′-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkF’/-3′ ГУСБ РНК Предусилительация ПЦР ГУСБ Вперед 1: 5′-АКК TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3′ GUSB Обратный 1: 5′- GTT CAA ACA GAT CAC ATC ATA ATA C-3′ ПЦР в реальном времени ГУСБ Вперед 2: 5′-TGC TGG CTA CTT GAA GAT G-3′ GUSB Обратный 2: 5′- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3′ ГУСБ-ХЕКС: 5′-/5HEX/TCGCACA/ЗЕН/CCAAATCCTGGACC/3IABkF/-3′ Таблица 2: Праймер и последовательности зондов для количественной оценки ДНК ВИЧ и РНК.

Discussion

В этом мы описали метод обработки жидкости BAL для получения CD4 Т-клеток и AMs, наряду с соответствующими ПБМК, которые могут быть изучены для исследования резервуара ВИЧ в легких. Недавно мы сообщили о количественной оценке ДНК ВИЧ в КЛЕТКах CD4 Т из соответствующих периферических образцов крови и BAL, и наша группа показала, что ВИЧ в 13 раз больше в легочных КЛЕТКах CD4 T, чем в клетках периферической крови^15. Тем не менее, уровни ДНК ВИЧ в AMs являются донорами-зависимыми и поэтому, до сих пор не было последовательной корреляции между уровнями ДНК ВИЧ в лимфоцитах по сравнению с макрофагами¹⁵. Однако доступ к этим первичным подмноещем макрофаговных клеток будет жизненно важным инструментом для изучения этого вопроса и получения лучшего понимания вирусной нагрузки в легких в контексте резервуара ВИЧ.

В доарт эпохи и в ряде других исследований с использованием BAL жидкости, участники прошли бронхоскопию для того, чтобы диагностировать предполагаемую патологию или получить микробиологический диагноз для респираторных симптомов³. Тем не менее, мы смогли набрать участников без каких-либо активных легочных симптомов или патологий, и все участники подписали этические согласия форме¹⁵. Мы смогли набрать участников из нашего центра, которые принимали участие в других исследованиях, таких как скрининг-исследование спирометрии на обструктивную болезнь легких²⁴, а также тех, кто проходит другие исследовательские процедуры, такие как лейкаперез и Колоноскопия. Предыдущие исследования среди людей, живущих с ВИЧ, показали, что альтруизм является ключевым фактором, мотивирующим участие в научных исследованиях²⁵. Как и многие человеческие образцы, мы отметили большую изменчивость от человека к человеку. Существовал никоим образом не “предсказать”, из которых участники мы получим BAL с хорошим и плохим и плохой урожайности клеток. В отличие от периферической крови, которая дает довольно последовательное количество лимфоцитов, номера клеток в жидкости BAL очень изменчивы. Впрыскивание большего объема нормального солева в легкие (в надежде получить большую отдачу от жидкости BAL) не всегда возможно, так как большие объемы нормального солевая часто связаны с большим кашлем и более высоким риском лихорадки постбронхоскопии. Мы заметили, что использование меньшего (а не большего) диаметра бронхоскопа позволило респиратору глубже проникнуть в бронхи и получить жидкость, содержащую большее количество клеток. Последовательный вывод заключался в том, что курильщики табака имели гораздо большую долю АМ, чем лимфоциты в их жидкости BAL, которая, как ожидается, по мере поглощения мусора и твердых частиц. Кроме того, мы заметили, что жидкость BAL от курильщиков содержала мусор, который может блокировать используемое оборудование, такое как пЦР-машины и цитометры потока. Аналогичные проблемы могут наблюдаться в районах с высоким уровнем загрязнения или в районах с высоким уровнем загрязнения или в районах, где люди чаще подвергаются воздействию низкого качества воздуха.

Что касается их роли в создании резервуаров для ВИЧ и вирусной настойчивости, то ключевым фактором является чистота Т-клеток и АМ CD4. По этой причине мы решили использовать флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS) для получения очень чистой популяции клеток. Также возможно, что собранная жидкость BAL может быть загрязнена кровью, так как во время бронхоскопии ожидаются незначительные кровотечения; наличие наивных В-клеток будет означать это, и клетки могут быть вымыты в буфере лиза красных кровяных телец, чтобы обойти эту проблему. Еще одна проблема с изучением жидкости BAL относится к количественной воспалительной маркеров и цитокинов, которые важны для понимания сохранения ВИЧ²⁶. Как привили солен разбавляет BAL жидкости, уровни воспалительных посредников и цитокинов может быть трудно измерить. Хотя коэффициент коррекции мочевины был предложен для учета разбавления, есть относительно мало литературы, описывающей его использование^27,28.

АМ являются высокой аутофлуоресцентной, которая создает проблемы во время сортировки клеток и потока цитометрического анализа цинотипии. В частности, эффект более выражен у курильщиков, чьи АМ могут быть полностью черного цвета, что существенно влияет на их автофлюоресценцию. При возбуждении стандартным синим 488 нм лазером, am autofluorescence находится на пике примерно 540 нм, который перекрывается с флуоресценции спектры обычно используемых конъюгатов, таких как FITC и PE^29,30. Стоит отметить, что два отдельных лазера могут быть использованы для возбуждения FITC и PE (например, PE желтым/зеленым и FITC синим лазером 488). Чтобы преодолеть присущую автофлюоресценцию с FITC, мы использовали неокрашенные AMs для определения фоне автофлюоресценции. Кроме того, использование средств контроля за флуоресценцией минус один (FMO) может быть очень полезным для борьбы с этими техническими проблемами. Можно использовать более крупные бусы (например, 7,5 мкм), которые ближе по размеру для компенсации популяций макрофагов, по сравнению с меньшими бусинами (например, 3,0 мкм), которые могут быть использованы для компенсации популяций лимфоцитов. Еще более подходящим подходом было бы использовать небольшую часть клеток в качестве одного пятна управления, используя известный, высоко выраженный маркер на подмножестве, таких как HLA-DR или CD45, сопряжены с каждым из желаемых флюорохромов, что позволило бы гораздо больше точная компенсация, чем может быть достигнуто с бисером. В случае образцов курильщиков эта тактика особенно полезна, так как макрофаги гораздо крупнее и более автофлуоресцентны. Кроме того, с момента подготовки весь образец BAL может быть культивирован в тарелке перед сортировкой, как описано в разделе 3 протокола, чтобы позволить разделение популяций путем присоединения. Таким образом, адепт макрофаги могут быть изолированы от других непридерживаться клеток, таких как лимфоциты. Компенсация является гораздо менее сложной задачей, если лимфоциты и популяции АМ разделены, а не рассматриваются вместе; однако, полагаясь на присоединение приведет к потере макрофагов, что является важным фактором, когда число клеток уже ограничено. Кроме того, шаг присоединения может привести к нежелательной активации адептмонов, которые могут повлиять на результаты вниз по течению, генерируемые с помощью этих клеток. Значение эффективной сортировки клеток в более чистые популяции должно быть взвешено против ограничения наличия меньшего количества таких ячеек для последующих экспериментов.

Другие модели, в первую очередь моделя мурин, были использованы для изучения макрофагов иммунологических характеристик и биологии. Хотя эти модели чрезвычайно полезны и позволяют получить представление о типе ячейки, которым трудно манипулировать, они имеют ограничения. Многие из маркеров поверхности клеток различаются между мышами и людьми таким образом, что иммунофенотип человека AMs не до конца понял. Тем не менее, эта модель наячнтребует объединения нескольких мышей для анализов из-за низких количеств клеток, доступных от каждого животного. Кроме того, необходимость объединения образцов исключает соображения генетической предрасположенности и пола. Недавно было показано, что секс играет роль в инфекционности макрофагов ВИЧ-1 из-за разрозненных выражения фактора ограничения SAMHD-1³¹. Нечеловеческие приматы (NHP) представляют собой ближайшую к человеку модель и способствовали изучению инфекции вируса иммунодефицита (SIV) и его влияния на иммунную систему, обеспечивая понимание роли макрофагов, проживающих в тканях по сравнению с макрофагов, полученных моноцитами. В резус макаки, было также показано, что легкие макрофаг изоляты из BAL гавани репликации компетентных вирусов; вирусный анализ нароста (VOA) был использован для анализа поведения SIV в клетках-резидентах тканей³². Такой вывод имеет важное значение для исследований, но все еще должен быть проверен на людях, прежде чем он может быть применен, и высокая стоимость использования NHPs исключает использование больших популяций выборки. Кроме того, аМ-аМ для человека будут полезны для многих других применений, таких как анализы вирусных/микробных инфекций in vitro, а также при исследованиях других патогенных микроорганизмов, таких как туберкулез/ВИЧ-инфекция.

Materials

70 µm Sterile Cell Strainer	Fisher Scientific	22363548	Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting
ACH-2 Cells	NIH	349	HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4
BD FACSAria	BD Biosciences	N/A	Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)
BD LSRFortessa X-20	BD Biosciences	N/A	Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)
Bronchoscope	Olympus	BF-1TH190	EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm
Cell Disassociation Solution	Sigma	C5914	Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.
CD169  BB515	BD Biosciences	565353	Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry
CD14  BV786	BD Biosciences	563698	Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry
CD206  PE	BD Biosciences	555954	Mannose receptor antibody used for flow cytometry
CD3  Alexa700	BD Biosciences	557943	T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD4  PE-Cy5	BD Biosciences	555348	T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD45  PE Cy-7	BD Biosciences	557748	Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry
CD8  BV605	BD Biosciences	564116	T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CompBead Plus	BD	560497	Anti-mouse  Ig, κ  and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry
DNase I	Invitrogen	18068015	Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA
dNTP Set 100 mM	Invitrogen	10297-018	Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells
EDTA	Invitrogen	AM9912	Used to stop Dnase I enzyme activity
FBS	Wisent Bioproducts	080-150	Premium fetal bovine serum to supplement media
FcR Blocking Reagent, Human	Miltenyi	130-059-901	Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies
FlowJo v10	FlowJo LLC	N/A	Flow cytometry analysis software used for all analyses
HLA-DR  BV650	BD Biosciences	564231	MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry
HyClone HEPES solution	Fisher Scientific	SH3023701	Buffer providing maintenance of physiological pH
Live/Dead  APC-H7	Invitrogen	L34975	Viability marker used for flow cytometry
Lymphocyte Separation Medium (LSM)	Wisent Bioproducts	350-000-CL	Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001	Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1°C/minute, the optimal rate for cell preservation
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-41	Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples
PBS 1X	Wisent Bioproducts	311-010-CL	Phosphate buffered saline for cell washing and staining
PCR Tubes Corbett Rotor-Gene	Axygen	PCR-0104-C	4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene
PerfeCTa qPCR ToughMix	Quantabio	95112	2X concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates
QiaAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers
Rotor-Gene Q	Qiagen	9001550	Real-time PCR cycler
RPMI 1640 1X	Wisent Bioproducts	350-000-CL	Cell culture media
Sterile Water	Wisent Bioproducts	809-115-CL	DNase, RNase & protease free
Superscript™ III One-Step RT-PCR System	Invitrogen	12574018	RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2X Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	18038-042	Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10X PCR buffer, magnesium chloride
Transcription Factor Buffer Set	BD Biosciences	562725	Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer
Trypan Blue	Sigma	T8154	Viability dye to count cells using haemacytometer