Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가
Summary
중첩 된 범-리스 사 바이러스는 역 전사 중 합 효소 연쇄 반응을 특이 적으로 알려진 모든 리즈 사 바이러스를 검출 하기 위해 개발 되었다. 다른 동물 종의 광견병 뇌 샘플을 이용한 검증은이 방법이 금 표준 형광 항 체 시험에 상응 하는 민감도 및 특이성을 가지 며, 일상적인 광견병 진단을 위해 사용 될 수 있음을 보여주었다.
Abstract
가정 내에서 리 조 바이러스 의 광견병 바이러스 및 기타 종 종을 검출 하는 것은 Rhabdo비리대에 있어서, 상기 팬 리스 사 바이러스 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응 (중첩 된 rt-pcr)은 보존 된 영역을 검출 하기 위하여 개발 된 광견병 (N) 유전자의. 이 방법은 바이러스 RNA (cDNA)를 합성 하기 위한 프라이 머로 서의 템플릿 및 올리고 (dT)15 와 랜덤 hexamers로 서 바이러스가 있는 DNA를 사용 하 여 역 전사 (RT)를 적용 한다. 이어서, 바이러스 성 cDNA는 외부 프라이 머를 사용 하 여 1 라운드 PCR에서 845 bp N 유전자 단편을 증폭 하는 템플릿으로 사용 되 고, 이어서 제 2 라운드 형 PCR에 의해 내부 프라이 머를 이용 하 여 최종 371 bp 단편을 증폭 한다. 이 방법은 광견병 바이러스 (RABV)의 상이한 유전 적 clades를 검출할 수 있다. 중국에서의 10 년의 임상 광견병 진단 및 감시에서 8 개의 국내 동물 종에서 9624 두뇌 표본을 사용 하 여 유효성 검사는, 방법이 직접 형광에 비교 하 여 100% 감도 및 99.97% 특이성을가지고 있음을 보여주었습니다 항 체 시험 (지방), 세계 보건 기구 (WHO)와 동물 건강을 위한 세계 조직 (OIE)에 의해 권장 되는 금 표준 방법. 또한, 상기 방법은 또한 합성의 모방 검출에 의해 평가 된 바와 같이, 바이러스의 분류에 관한 국제 위원회의 제 10 회 보고서에서의 타겟 된 N 유전자 단편을 다른 승인 및 2 개의 신규 리 사이 바이러스 종들에 게 증폭 시킬 수 있다 모든 리즈 사 바이러스의 N 유전자 플라스 미드. 이 방법은 광견병 진단에 대 한 지방에 대 한 편리한 대안을 제공 하 고 중국의 국가 표준 (T36789)로 승인 되었습니다.
Introduction
광견병은 인 리스 사코 바이러스1내에서 바이러스에의 한 전 세계적으로 발생 한 질병입니다. 리스 사 바이러스 (가족 Rhabdo비리대)는 5 개의 단백질을 인코딩하는 약 12kb 게놈을 갖는 단일 음성 가닥 RNA 바이러스: N, phosphoprotein, 매트릭스 단백질 (G), 당단백질 및 큰 단백질 또는 중 합 효소 (L). N 유전자, 유전 거리 및 항 원 성 패턴의 뉴클레오티드 서 열에 기초 하 여, 리 사이 바이러스는 고전적인 광견병 바이러스 (RABV) 및 광견병 관련 바이러스 (RRV)를 포함 하는 16 종으로 구분 되었다: 라고스 박쥐 바이러스 ), 모 코 롤라 바이러스 (MOKV), 유럽 박쥐 리스 사 바이러스 1 (EBLV-1), 브라질의 박쥐 리스 사 바이러스 2 (EBLV), 아 라 반 바이러스의 아 반 바이러스,이 코 코 (IKOV),이 르 쿠 바이러스 (GBLV), Irkut (IRKUT), (이로 브 루), Gannoruwa Khujand 바이러스 (쿠 브), 웨스트 코 카 서 스 박쥐 바이러스 (WCBV), 시 나 니 박쥐 바이러스 (L레프) 및 레이다 박쥐 리스 사 바이러스 최근 두 가지 추가 리 사이 바이러스가 확인 되었습니다: 일본 pipistrelle 에서 고립 된 2017 3 및 대만 박쥐 리스 사 바이러스 (Twblv)에서 브란트의 브랜드 박쥐 (myotis 브랜디 티) 로부터 고립 된 (kblv) Pipistrellus abramus), 중국 대만에서 2016 년-20174.
모든 포유류는 광견병에 취약 합니다. 그러나, 총 병리학 적 병 변 또는 특정 임상 징후는 그것의 식별을 허용 하지 않으며, 진단은 실험실 에서만 만들 수 있습니다5. 광견병 진단을 위한 가장 널리 사용 되는 방법은 지방, 누구와 oie5에 의해 금 표준으로 간주 됩니다.,6. 그럼에도 불구 하 고, 지방은 저하/자동 화 된 뇌 조직 샘플에 대 한 신뢰할 수 없는 결과를 생성 합니다. 추가적으로, 뇌 척 수액 (CSF), 타 액 및 소변과 같은 생물학적 유체 표본을 분석 하는 데 사용할 수 없으며,이로 인해 antemortem 진단7에서의 고용을 크게 배제 합니다. 광견병 조직 배양 감염 시험 (RTCIT) 및 마우스 접종 시험 (MIT)과 같은 대안적인 종래의 진단 시험은 신속한 진단이 필수적 일 때 주요한 단점이 있고, 며칠6을 필요로 한다.
다양 한 분자 진단 시험 (예를 들어, RT-PCR에의 한 바이러스 성 RNA의 검출, 효소-결합 면역 흡착 분석 법 [PCR ELISA], 현장 혼성 화 및 실시간 PCR)은 광견병 진단8에 대 한 신속 하 고 민감한 기술로 사용 된다. RT-PCR은 현재 일상적인 광견병 진단을 위해 OIE에 의해 권장 되 고 있으며, 각 리 사 바이러스5를 검출 하는 것은 지상 동물에 대 한 진단 검사 및 백신의 Oie 매뉴얼에 기재 되어 있다. 여기에서 우리는 지방에 의해 얻어진 것에 필적 하거나 초과 하는 모든 18 개의 리 사 바이러스 종의 특이 하 고 민감한 검출을 허용 하는 범 리 사 바이러스 중첩 RT-PCR을 설명 한다. 상기 방법의 원리는 표적 RNA (리즈 사 바이러스 N 유전자의 보존 부위)를 cDNA로 넣고, 2 차례의 PCR로 cDNA의 증폭을 따른다. 상기 cDNA는 845 bp 단편을 증폭 하기 위해 외부 프라이 머로 1 라운드 PCR을 겪는 다; 이어서, 상기 제 2 라운드 pcr은 371 bp 단편을 내부 프라이 머로 증폭 하기 위한 템플릿으로 서 1 라운드 PCR 산물을 사용 한다. PCR의 2 개의 라운드는 분석의 감도를 현저 하 게 증가 시킵니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 RABV는 중국의 거의 모든 인간과 동물 광견병 뿐만 아니라 다른 나라에 대 한 책임을 맡고 있는 주요 리 사이 바이러스입니다. 또한, IRKV 변이체는 2012에서 중국 북동부에 있는 길 림 성의 Murina leucogaster 박쥐 로부터 먼저 확인 되었고, 201711에 있는 랴오닝 성에 서 개 사망을 야기 하는 것으로 보고 되었다. 가장 최근에는, 2017에서 대만, 중국의 일…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국가 주요 연구 개발 계획 (보조금 번호 2016YFD0500401)과 중국의 국립 자연 과학 재단 (보조금 31302043)에 의해 지원 되었다.
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
Riferimenti
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