iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현 복원에 있는 CRISPR/Cas9 기술
Summary
여기서, 우리는Dmdmdx 마우스 유래 피부 섬유아세포로부터 iPSC에서 디스트로핀 발현을 복원하고 Tet-on MyoD 활성화 시스템을 사용하여 iPSC를 myogenic 전구 세포(MPC)로 직접 분화하는 Cas9 기반 exon23 결실 프로토콜을 제시한다.
Abstract
Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 궁극적으로 근육 전구 세포의 고갈로 이끌어 내는 dystrophin 유전자에 있는 돌연변이에 기인한 가혹한 진보적인 근육 질병입니다. 클러스터된 정기적으로 연속된 짧은 palindromic 반복/CRISPR 관련 9 (CRISPR/Cas9) 유전자 편집은 디스트로핀 유전자의 발현을 회복시킬 수 있는 잠재력을 갖는다. 자가성 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)-유래 근육 전구 세포 (MPC)는 줄기 / 전구 세포 풀을 보충하고 손상을 복구하며 면역 반응을 일으키지 않고 DMD에서 추가 합병증을 예방 할 수 있습니다. 이 연구에서는 CRISPR/Cas9 및 비통합 iPSC 기술의 조합을 도입하여 회복된 디스트로핀 단백질 발현을 가진 근육 선조를 얻습니다. 간략하게, 우리는 Dmdmdx 마우스의 진피 섬유아세포로부터 iPSC 라인을 확립하기 위해 비통합 센다이 벡터를 사용합니다. 그런 다음 CRISPR/Cas9 결실 전략을 사용하여 재프레임된 디스트로핀 유전자의 비상동성 말 결합을 통해 디스트로핀 발현을 복원합니다. 94개의 iPSC 콜로니에서 3개의 콜로니에서 exon23 고갈의 PCR 검증 후, 우리는 근육 분화 조절에 중요한 역할을 하는 주요 전사 인자인 MyoD의 독시사이클린(Dox)-유도 발현에 의해 iPSC를 MPC로 분화합니다. 우리의 결과는 DMD의 처리를 위한 미래 치료를 개발하기 위한 중요한 잠재력을 가지고 있는 iPSC 파생된 MPC에 있는 dystrophin 표현을 복구하기 위하여 CRISPR/Cas9 삭제 전략을 사용하는 타당성을 보여줍니다.
Introduction
Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 가장 일반적인 근 이영양증의 한개이고 전세계 대략 5,000명의 신생아 소년의 1에 영향을 미치는 dystrophin의 부재에 의해 특징입니다1. 디스트로핀 유전자 기능의 손실은 진보적 인 myofibers 변성으로 이어지는 구조적 근육 결함을초래1,2. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)-매개 유전자 치료 시스템은 마이크로 디스트로핀(μ-Dys)을 이용한 유전자 교체와 같은 디스트로핀 발현을 복원하고 근육 기능을 향상시키는 것으로 시험되었다. 그러나, rAAV 접근법은 기능성 단백질3,4의발현을 유지하기 위해 반복주사를 요구한다. 따라서, 우리는 DMD를 가진 환자에 있는 dystrophin 유전자 발현을 효과적이고 영구적으로 복구할 수 있는 전략이 필요합니다. DMD를 위한 마우스 모델인Dmdmdx 마우스는, 조기 종결 코동을 도입하고 C 말단 디스트로글리칸 결합 도메인이 결여된 비기능성 잘린 단백질을 초래하는 디스트로핀 유전자의 엑소(23)에서 포인트 돌연변이를 갖는다. 최근 연구는 크고 작은동물5,6,7에서정확한 유전자 보정 또는 돌연변이 엑시온 결실에 의해 디스트로핀 유전자 발현을 복원하는 CRISPR/Cas9 기술의 사용을 입증하였다. Long etal.8은 상동성 지향 수리(HDR) 기반 CRISPR/Cas9 게놈 편집에 의해Dmdmdx 마우스 생식선에서 디스트로핀 유전자 돌연변이를 교정하는 방법을 보고했다. 엘 레페이 외9 는 rAAV가 영양 실조 마우스에서 돌연변이 엑슨 23을 효율적으로 소비 할 수 있다고보고했다. 이 연구 결과에서, gRNAs는 비 상동성 끝 접합을 통해 DNA 복구 후에 디스트로핀 발현을 부분적으로 복구하는 이중 좌초된 DNA 중단을 일으키는 원인이 되기 위하여 인트론 20 및 23에서 디자인되었습니다 (NHEJ). 더욱 흥미진진한, Amoasii 등10은 최근 개 모델에서 디스트로핀 발현을 복원하는 데 있어 rAAV 매개 CRISPR 유전자 편집의 효능 및 타당성을 보고했으며, 이는 향후 임상 적용에 필수적인 단계이다.
DMD는 또한 줄기 세포 무질서(11)를일으키는 원인이 됩니다. 근육 손상에 대 한, 주거 근육 줄기 세포 근육 분화 후 죽어가는 근육 세포를 보충. 그러나, 상해 및 수리의 연속적인 주기는 근육 줄기 세포(12)에서텔로미어의 단축으로 이어지고, 줄기 세포 풀의 조기 고갈13,14. 따라서, 디스트로핀 발현을 복원하기 위한 게놈 편집과 자가 줄기 세포 요법의 조합은 DMD 를 치료하기 위한 실용적인 접근법이 될 수 있다. CRISPR/Cas9 기술은 기능적인 근육 재생을 위해 자가 수정된 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하고 면역 거부를 일으키지 않으면서 DMD의 추가 합병증을 예방할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나, iPSCs는 myogenic 전구 세포로 iPSC의 분화에 의해 완화될 수 있던 종양 대형의 리스크가 있습니다.
이 프로토콜에서는Dmdmdx 마우스의 진피 섬유아세포를 iPSCs로 재프로그래밍한 다음 CRISPR/Cas9 게놈 삭제에 의한 디스트로핀 발현을 복구하기 위해 비통합 Sendai 바이러스의 사용을 설명합니다. 유전자 형이 나는 에 의해 iPSC에서 Exon23 삭제의 검증 후, 우리는 MyoD 유도 myogenic 분화를 통해 myogenic 선조 (MPC)로 게놈 보정 iPSC를 분화.
Protocol
Representative Results
Discussion
듀첸 근이영양증(DMD)은 디스트로핀의 부족을 특징으로 하는 파괴적이고 궁극적으로 치명적인 유전질환으로, 진행성 근육 위축으로 이어지는1,2. 우리의 결과는 CRISPR/Cas9 매개 exon23 결실의 접근법에 의해Dmdmdx iPSC 유래 myogenic 전구 세포에서 복원된 디스트로핀 유전자 발현을 입증한다. 이 방법은 세 가지 장점이 있습니다.
첫?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
탕과 와인트라우브는 NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
Riferimenti
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