Syntes, funktionalisering och karakterisering av Fusogenic porösa Silicon nanopartiklar för oligonukleotiden leverans
Summary
Vi visar syntesen av fusogenic porösa kisel nanopartiklar för effektiv in vitro- och in vivo oligonukleotiden leverans. Porösa kisel nanopartiklar är laddade med siRNA bildar kärnan, som täckas av fusogenic lipider genom extrudering att bilda skalet. Inriktning biexponentiellt funktionalisering och partikel karakterisering ingår.
Abstract
Med tillkomsten av genterapi blivit utvecklingen av en effektiv Invivo nukleotid-nyttolast leveranssystem av parallellimport. Fusogenic porösa kisel nanopartiklar (F-pSiNPs) har nyligen visat hög Invivo nedtystning effekt på grund av dess höga oligonukleotiden laddar kapacitet och unika cellernas upptag gångstig som undviker endocytos. Syntesen av F-pSiNPs är en process i flera steg som omfattar: (1) lastning och tätning av oligonukleotiden nyttolaster kisel porer; (2) samtidig beläggning och dimensionering av fusogenic lipider runt de porösa kisel gjutkärnor; och (3) Konjugation av riktade peptider och tvättning för att avlägsna överflödig oligonukleotiden, kisel skräp och peptid. Den partikelns storlek enhetlighet kännetecknas av dynamiska ljusspridning och dess core-shell struktur kan verifieras genom transmissionselektronmikroskopi. Fusogenic upptaget valideras av lastning en lipofila dye, 1, 1-dioctadecyl-3,3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DiI), in i den fusogenic lipid lipidens och betraktar det till celler in vitro-att observera för plasma membran färgning kontra endocytic lokaliseringar. De inriktning och in vivo gen tysta efficacies kvantifierades tidigare i en musmodell av stafylokocker lunginflammation, där den inriktning peptiden förväntas hjälpa den F-pSiNPs hem till platsen för infektion. Utöver dess tillämpning i S. aureus infektion, kan F-pSiNP systemet användas att leverera någon oligonukleotiden för genterapi av ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive virala infektioner, cancer och autoimmuna sjukdomar.
Introduction
Genterapi modulerar specifik genuttryck för att erhålla en terapeutiska resultat. Många verktyg för genen modulering har upptäckts och studerat, inklusive ribonukleinsyra störningar (RNAi) använder oligonukleotider (t.ex. kort störande RNA (siRNA)1,2, mikroRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmider5,6, nukleaser (t.ex. zink finger, TALENS)7,8och CRISPR/Cas9-system9,10. Medan varje verktygets verkningsmekanism skiljer sig, måste alla verktyg når cellens cytoplasma eller kärnan till vara aktiv. Som sådan, medan dessa verktyg har visat signifikant effekt i modulerande genuttryck in vitro-, lider in vivo effekten av extracellulära och intracellulära hinder. På grund av att verktygen är av biologiskt ursprung, finns många enzymer och system för tullklarering i vår kropp som har förmågan att försämra eller ta bort främmande molekyler11. Även i fallet lider att verktygen når målcellen, de av endocytos; ett läge i cellernas upptag som kapslar och fällor verktygen i sura magen-liknande blåsor som försämra eller utvisa verktyg ur cellen. I själva verket, har studier visat att lipid nanopartiklar är endocytosed via macropinocytosis, som är ungefär 70% av siRNA exocytosed från cellerna inom 24h upptag12,13. Majoriteten av de återstående siRNA bryts via lysosomala vägen, och i slutändan endast 1-2% av den siRNA som initialt går in i cellen med nanopartiklar uppnå endosomal fly potentiellt genomgå RNAi13,14 .
Nyligen har vi utvecklat fusogenic porösa kisel nanopartiklar (F-pSiNPs) som har en siRNA-laddad kärna består av porös kisel nanopartiklar och en fusogenic lipid skal15. De F-pSiNPs presentera tre stora fördelar framför andra konventionella oligonukleotiden leverans system: (1) en fusogenic lipid beläggning vilket gör att partiklarna att kringgå endocytos och leverera hela nyttolasten direkt i cellens cytoplasma (jämfört med 1-2% uppnås genom endocytosed partiklar13,14) (figur 1). (2) hög massa lastning av siRNA i pSiNPs (> 20 wt % jämfört med 1-15 wt % av konventionella system)15, som snabbt försämras i cytoplasman (när core partiklarna skjul lipid beläggningen via fusogenic upptag) för att släppa siRNA; och (3) inriktning peptid konjugation för selektiv homing till önskade celltyper Invivo.
F-pSiNP systemet har visat betydande nedtystning effekten (> 95% in vitro-; > 80% i vivo) och efterföljande terapeutisk effekt i en dödlig utgång musen modell av S. aureus lunginflammation; resultaten av som publicerades tidigare15. Den komplexa strukturen av F-pSiNP systemet kräver dock känslig hantering och finjusteras optimering att generera enhetlig och stabil nanopartiklar. Syftet med detta arbete är således att presentera en grundlig protokoll, samt optimering strategier för syntes, funktionalisering och karakterisering av F-pSiNPs som ska användas i riktade leverans av siRNAs för potenta gen tysta effekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syntesen av porösa kisel nanopartiklar visas i figur 5. Det kritiska steget i syntesen av fusogenic pSiNPs är i lastning steg (steg 3). Om de fusogenic nanopartiklarna aggregera efter syntes (figur 3), anledningen kan bero på följande: (1) kalciumklorid aktie var likartad inte beredd, alltså steg 3.1.2 skall noggrant följt eller raffinerade; eller (2) förhållandet mellan pSiNP: siRNA: CaCl2 eller koncentrationen av en eller flera av de tre kom…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Institutes of Health genom kontrakt nr R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
Riferimenti
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -. J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub> Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
