Den beskrevne rørledningen er utformet for segmentering av elektron mikroskopi datasett som er større enn gigabyte, for å trekke ut hele celle morfologier. Når cellene er rekonstruert i 3D, tilpasset programvare designet rundt individuelle behov kan brukes til å utføre en kvalitativ og kvantitativ analyse direkte i 3D, også ved hjelp av virtuell virkelighet å overvinne vise okklusjon.
Serial snitting og påfølgende Høyoppløselig bilde av biologisk vev ved hjelp av elektron mikroskopi (EM) tillater segmentering og rekonstruksjon av høyoppløselig avbildet stabler å avdekke ultrastructural mønstre som ikke kunne løses ved hjelp av 2D Bilder. Faktisk kan sistnevnte føre til en feil tolkning av morfologier, som i tilfelle av mitokondrier; Bruk av 3D-modeller er derfor mer og mer vanlig og brukt på formuleringen av morfologi-baserte funksjonelle hypoteser. Til dags dato gjør bruk av 3D-modeller generert fra lys eller elektron bilde stabler kvalitative, visuelle vurderinger, så vel som kvantifisering, mer praktisk å bli utført direkte i 3D. Ettersom disse modellene er ofte svært komplekse, er en virtuell virkelighet miljø også viktig å være satt opp til å overvinne okklusjon og å dra full nytte av 3D-strukturen. Her er en steg-for-steg guide fra bilde segmentering til rekonstruksjon og analyse er beskrevet i detalj.
Den første foreslåtte modellen for et elektron mikroskopi oppsett slik at automatiserte serielle delen og Imaging dateres tilbake til 19811; spredningen av slike automatiserte, forbedret oppsett til bilde store prøver å bruke EM økt i de siste ti årene2,3, og arbeider utstillingsvindu imponerende tette rekonstruksjoner eller full morfologier umiddelbart fulgt4, 5,6,7,8,9,10.
Produksjonen av store datasett kom med behovet for forbedrede rørledninger for bilde segmentering. Programvareverktøy for manuell segmentering av serielleseksjoner, sliksom rekonstruereog TrakEM2,ble utformet for overføring av elektron mikroskopi (TEM). Som hele prosessen kan være svært tidkrevende, disse verktøyene er ikke hensiktsmessig når du arbeider med tusenvis av serielle micrographs som kan automatisk generert med State-of-the-art, automatiserte EM seriell del teknikker (3DEM), for eksempel blokk-ansikt skanning elektron mikroskopi (SBEM)3 eller fokusert ion Beam-Scanning elektron MIKROSKOPI (LØGN-SEM)2. Av denne grunn, forskere legger innsats i å utvikle semi-automatiserte verktøy, samt helautomatisk verktøy, for å forbedre segmentering effektivitet. Helautomatisk verktøy, basert på maskinlæring13 eller State-of-the-art, uerfarne pixel klassifisering algoritmer14, blir forbedret for å brukes av et større fellesskap; Likevel er segmentering fortsatt langt fra å være fullt pålitelig, og mange arbeider er fortsatt basert på manuell arbeidskraft, som er ineffektiv i forhold til segmentering tid, men likevel gir fullstendig pålitelighet. Semi-automatiserte verktøy, for eksempel ilastik15, representerer et bedre kompromiss, som de gir en umiddelbar avlesning for segmentering som kan korrigeres til en viss grad, selv om det ikke gir en reell korrekturlesing rammeverk, og kan integreres ved hjelp av TrakEM2 i parallell16.
Stor skala segmentering er hittil, for det meste begrenset til connectomics; Derfor er dataforskere mest interessert i å tilby rammeverk for integrerte visualiseringer av store, kommenterte datasett og analysere tilkoblings mønstre utledes av tilstedeværelsen av Synaptic kontakter17,18. Likevel kan nøyaktige 3D-rekonstruksjoner brukes til kvantitative morphometric analyser, i stedet for kvalitative vurderinger av 3D-strukturene. Verktøy som NeuroMorph19,20 og glykogen analyse10 er utviklet for å ta målinger på 3D-rekonstruksjoner for lengder, overflateområder og volumer, og på fordelingen av Sky poeng, helt forkaster den opprinnelige EM-stakken8,10. Astrocytter representerer en interessant case-studie, fordi mangelen på visuelle ledetråder eller repeterende strukturelle mønstre gi etterforskere et hint om funksjonen til individuelle strukturelle enheter og påfølgende mangel på en adekvat ontologi av astrocytic prosesser 21, gjør det utfordrende å designe analytiske verktøy. Et siste forsøk var Abstractocyte22, som tillater en visuell utforskning av astrocytic prosesser og den slutning av kvalitative relasjoner mellom astrocytic prosesser og neurites.
Likevel, bekvemmeligheten av tenkelig delt vev under EM kommer fra det faktum at mengden av informasjon gjemt i intakt hjerne prøver er enorm og tolke enkelt del bilder kan overvinne dette problemet. Tettheten av strukturer i hjernen er så høy at 3D rekonstruksjoner av enda noen objekter synlig på en gang ville gjøre det umulig å skille dem visuelt. Av denne grunn har vi nylig foreslått bruk av Virtual Reality (VR) som en forbedret metode for å observere komplekse strukturer. Vi fokuserer på astrocytter23 for å overvinne okklusjon (som er blokkering av synligheten av et objekt av interesse med en andre, i et 3D-rom) og lette kvalitative vurderinger av rekonstruksjoner, inkludert korrekturlesing, samt quantifications av funksjoner ved hjelp av antall poeng i rommet. Vi kombinerte nylig VR visuell utforskning med bruk av GLAM (glykogen-avledet melkesyre absorpsjons modell), en teknikk for å visualisere et kart over neurites av melkesyre shuttle, ved å vurdere glykogen granulat som lys-Emitting organer23; spesielt brukte vi VR til å kvantifisere de lyse toppene produsert av GLAM.
Metoden som presenteres her er en nyttig steg-for-steg guide for segmentering og 3D rekonstruksjon av en multiscale EM datasett, enten de kommer fra høyoppløselig Imaging teknikker, som liten LØGN-SEM, eller andre automatiserte seriell snitting og Imaging teknikker. Liten LØGN-SEM har fordelen av potensielt nå perfekt isotropisk i Voxel størrelse ved å kutte seksjoner så tynne som 5 NM ved hjelp av en fokusert ion strålen, dens FOV kan være begrenset til 15-20 μm grunn av side gjenstander, som er muligens på grunn av deponering av kuttet vev hvis FO V overskrider denne verdien. Slike gjenstander kan unngås ved hjelp av andre teknikker, for eksempel SBEM, som bruker en diamant kniv til å kutte serielle seksjoner inne i mikroskopet kammeret. I dette sistnevnte tilfellet kan z -oppløsningen være rundt 20 NM i beste fall (vanligvis, 50 NM), men FOV kan være større, selv om piksel oppløsningen bør forringes for et stort område av interesse. En løsning for å overvinne slike begrensninger (forstørrelse g. FOV) er å dele regionen av interesse i fliser og erverve hver av dem på en høyere oppløsning. Vi har vist her resultater fra både en SBEM stack-datasett (i) i representative resultater-og en liten LØGN-SEM stabel-datasett (II) i representative resultater.
Ettersom generering av større og større datasett blir stadig mer vanlig, er arbeidet med å lage verktøy for piksel klassifisering og automatisert bilde segmentering multiplisere; Likevel, hittil har ingen programvare bevist pålitelighet sammenlignes med menneskets korrekturlesing, som derfor fortsatt er nødvendig, uansett hvor tidkrevende det er. Generelt kan mindre datasett som kan Nedsamples, for eksempel når det gjelder datasett (II), bli tett rekonstruert av en enkelt Ekspertbruker i en uke, inkludert korrekturlesing tid.
Protokollen som presenteres her innebærer bruk av tre programmer spesielt: Fiji (versjon 2.0.0-RC-65/1.65 b), ilastik (versjon 1.3.2 RC2), og blender (2,79), som alle er åpen kildekode og multi-plattform programmer og nedlastbare gratis. Fiji er en utgivelse av ImageJ, drevet av plugins for biologiske bildeanalyse. Den har en robust programvarearkitektur og foreslås som det er en felles plattform for livet forskere og inkluderer TrakEM2, en av de første og mest brukte plugins for bilde segmentering. Et problem som oppleves av mange brukere i det siste er overgangen fra Java 6 til Java 8, som skaper kompatibilitetsproblemer; Derfor foreslår vi avstå fra å oppdatere til Java 8, hvis mulig, for å tillate Fiji å fungere skikkelig. ilastik er en kraftfull programvare som gir en rekke rammeverk for Pixel klassifisering, hver og en dokumentert og forklart på deres hjemmeside. Den carving modul som brukes for semi-automatisert segmentering av EM stabler er praktisk som det sparer mye tid, slik at forskerne å redusere tiden brukt på manuelt arbeid fra måneder til dager for en erfaren bruker, som med et enkelt klikk en hel neurite kan være segmentert i sekunder. Den forbehandling trinnet er svært intens fra en hardware synspunkt, og svært store datasett, som SBEM stabelen presenteres her, som var 26 GB, krever særegne strategier for å passe inn i minnet, med tanke på at man skulle erverve store datasett fordi kan ikke kompromittere synsfelt og oppløsning. Det kan derfor hende at samplingsreduksjon ikke er en hensiktsmessig løsning i dette tilfellet. Den nyeste versjonen av programvaren kan gjøre forbehandling i et par timer med en kraftig Linux arbeidsstasjon, men segmentering ville ta minutter, og bla gjennom stabelen vil fortsatt være relativt treg. Vi bruker fortsatt denne metoden for en første, grov segmentering, og korrekturlese den ved hjelp TrakEM2. Endelig er blender en 3D-modellering programvare, med en kraftig 3D rendering motoren, som kan tilpasses med Python skript som kan bygges inn i hoved GUI som add-ons, slik som NeuroMorph og glykogen analyse. Fleksibiliteten av denne programvare kommer med det ulempen det, inne kontrasten å Fiji, for eksempel, det er ikke beregnet på det online visualisering av stor datasett; Derfor kan visualisering og navigering gjennom store nett (overstiger 1 GB) være treg og ikke effektiv. På grunn av dette, er det alltid tilrådelig å velge teknikker som reduserer mesh kompleksitet, men er forsiktig med å forstyrre den opprinnelige morfologi av strukturen av interesse. Det remesh funksjonen kommer inne hendig og er en lagt ned i ansiktstrekk av det NeuroMorph bakst import verktøyet. Et problem med denne funksjonen er at, avhengig av antall hjørner av det opprinnelige mesh, octree dybde verdi, som er relatert til den endelige oppløsningen, bør endres tilsvarende. Små gjenstander kan være remeshed med en liten octree dybde (f. eks 4), men den samme verdien kan forstyrre morfologi av større objekter, som trenger større verdier (6 i beste fall, til 8 eller 9 for en veldig stor mesh, for eksempel en full celle). Det er tilrådelig å gjøre denne prosessen gjentakende og teste de ulike octree dybder Hvis størrelsen på objektet er ikke klart.
Som nevnt tidligere, et aspekt som bør tas i betraktning er beregningsorientert kraft til å være dedikert til gjenoppbygging og analyse, knyttet til programvaren som brukes. Alle operasjonene vist i representative resultatene av dette manuskriptet ble innhentet ved hjelp av en Mac Pro, utstyrt med en AMD FirePro D500 grafikkort, 64 GB RAM, og en Intel Xeon E5 CPU med 8 kjerner. Fiji har en god programvarearkitektur for håndtering av store datasett. Derfor anbefales det å bruke en bærbar datamaskin med en god maskinvareytelse, for eksempel en MacBook Pro med en Intel i7-prosessor på 2,5 GHz og 16 GB RAM. ilastik programvare er mer krevende når det gjelder maskinvareressurser, spesielt under forbehandling trinn. Selv om reduksjon av bildes takken er et godt knep for å begrense maskinvare forespørslene fra programvaren, og lar brukeren behandle en stabel med en bærbar datamaskin (vanligvis hvis den er under 500 piksler i x,y,z), foreslår vi at du bruker en high-end datamaskinen til å kjøre denne programvaren jevnt. Vi bruker en arbeidsstasjon utstyrt med en Intel Xeon Gold 6150 CPU med 16 kjerner og 500 GB RAM.
Når det følger med en nøyaktig 3D-rekonstruksjon, kan forskerne forkaste de opprinnelige micrographs og arbeide direkte på 3D-modellene for å trekke ut nyttige morphometric data for å sammenligne celler av samme type, i tillegg til ulike typer celler, og dra nytte av VR for kvalitative og kvantitative vurderinger av morfologier. Spesielt har bruken av sistnevnte vist seg å være fordelaktig når det gjelder analyser av tette eller komplekse morfologier som presenterer visuell okklusjon (dvs. blokkering av visning av et objekt av interesse i 3D-rommet med en andre en plassert mellom observatøren og Fi første objekt), noe som gjør det vanskelig å representere og analysere dem i 3D. I eksempelet som ble presentert, tok en erfaren bruker ca 4 påfølgende timer for å observere datasettene og telle objektene. Tiden som brukes på VR-analyser kan variere ettersom aspekter som VR sykdom (som til en viss grad kan være relatert til bilsyke) kan ha en negativ innvirkning på brukeropplevelsen; i dette tilfellet kan brukeren foretrekke andre analyseverktøy og begrense tiden som er dedikert til VR.
Til slutt, alle disse trinnene kan brukes på andre mikroskopi og ikke-EM teknikker som genererer bilde stabler. EM genererer bilder som generelt er utfordrende å håndtere og segmentere, sammenlignet med for eksempel fluorescens mikroskopi, der noe kan sammenlignes med en binær maske (signal kontra en svart bakgrunn), som i prinsippet kan lett gjengis i 3D for videre behandling, må ofte håndteres.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av King Abdullah University of Science and Technology (KAUST) konkurransedyktige Research Grants (CRG) Grant “KAUST-BBP Alliance for Integrative modellering av Brain Energy metabolisme” til P.J.M.
Fiji | Open Source | 2.0.0-rc-65/1.65b | Open Source image processing editor www.fiji.sc |
iLastik | Open Source | 1.3.2 rc2 | Image Segmentation tool www.ilastik.org |
Blender | Blender Foundation | 2.79 | Open Source 3D Modeling software www.blender.org |
HTC Vive Headset | HTC | Vive / Vive Pro | Virtual Reality (VR) Head monted headset www.vive.com |
Neuromorph | Open Source | — | Collection of Blender Addons for 3D Analysis neuromorph.epfl.ch |
Glycogen Analysis | Open Source | — | Blender addon for analysis of Glycogen https://github.com/daniJb/glyco-analysis |
GLAM | Open Source | — | C++ Code For generating GLAM Maps https://github.com/magus74/GLAM |