Spectral Imaging har blivit en pålitlig lösning för identifiering och separation av multipla fluorescenssignaler i ett enda prov och kan lätt urskilja signaler av intresse från bakgrund eller autofluorescence. Excitation-scanning Hyperspektrala Imaging förbättrar denna teknik genom att minska den nödvändiga bilden förvärvs tid samtidigt öka signal-brus-förhållande.
Flera tekniker förlitar sig på detektion av fluorescenssignaler för att identifiera eller studera fenomen eller för att belysa funktioner. Separation av dessa fluorescenssignaler var bevisat besvärliga fram till tillkomsten av Hyperspektrala avbildning, där fluorescens källor kan separeras från varandra samt från bakgrunds signaler och autofluorescence (ges kunskap om deras spektrala signaturer). Men traditionella, utsläpp scanning Hyperspektrala avbildning lider av långsamma förvärvs tider och låg signal-brus-förhållanden på grund av den nödvändiga filtreringen av både excitation och utsläpp ljus. Det har tidigare visats att excitation-scanning Hyperspektrala Imaging minskar den nödvändiga förvärvs tiden samtidigt öka signal-brus-förhållandet av förvärvade data. Med hjälp av kommersiellt tillgänglig utrustning beskriver detta protokoll hur man monterar, kalibrerar och använder en excitation-scanning Hyperspektrala Imaging mikroskopi system för separation av signaler från flera fluorescenskällor i ett enda prov. Även om det är mycket tillämpligt på mikroskopisk avbildning av celler och vävnader, kan denna teknik också vara användbar för alla typer av experiment som utnyttjar fluorescens där det är möjligt att variera excitation våglängder, inklusive men inte begränsat till: kemisk avbildning, miljötillämpningar, ögonvård, livsmedelsvetenskap, forensisk vetenskap, medicinsk vetenskap och mineralogi.
Spektralavbildning kan utföras på olika sätt och refereras till av flera termer1,2,3,4. I allmänhet avser spektral avbildning data som erhållits i minst två rumsliga dimensioner och en spektraldimension. Multispektrala och Hyperspektrala avbildning kännetecknas oftast av antalet våglängdsband eller om spektralbanden är sammanhängande1. För detta program definieras Hyperspektrala data som spektrala data som erhållits med sammanhängande våglängd band uppnås genom avstånd av centrum våglängder inte mindre än halva full bredd på halva Max (FWHM) av varje bandpass filter som används för excitation (dvs 5 nm mittvåglängdsavstånd för bandpass-filter med 14-20 nm bandbredder). Den sammanhängande karaktären hos data banden möjliggör en översampling av DataSet, vilket säkerställer att Nyquists kriterier uppfylls vid provtagning av spektraldomänen.
Hyperspektrala Imaging utvecklades av NASA under 1970-och 1980-talen i samband med den första LANDSAT Satellite5,6. Att samla in data från flera sammanhängande spektralband tillät uppkomsten av ett utstrålande spektrum av varje pixel. Identifiering och definition av strålningsspektrat av enskilda komponenter gjorde det möjligt att inte bara detektera ytmaterial genom sina karakteristiska spektra, utan också tillåtet för avlägsnande av mellanliggande signaler, såsom variationer i signalen på grund av atmosfäriska förhållanden. Konceptet att detektera material med hjälp av deras karakteristiska spektra tillämpades på biologiska system i 1996 när schröck et al. använde kombinationer av fem olika fluoroforer och deras kända spektra för att särskilja märkta kromosomer i en process som kallas spektralkaryotypning7. Denna teknik utarbetades på 2000 av Tsurui et al. för fluorescens Imaging av vävnadsprover, med hjälp av sju fluorescerande färgämnen och singular värde nedbrytning för att uppnå spektral separation av varje pixel i linjära kombinationer av spektra i referens bibliotek8. Liknar deras fjärranalys motsvarigheter, kan bidraget från varje känd fluorophore beräknas från Hyperspektrala bilden, ges a priori information om spektrumet av varje fluorophore.
Hyperspektral avbildning har också använts inom jordbruksområdet9, astronomi10, biomedicin11, kemisk avbildning12, miljötillämpningar13, ögonvård14, Food Science15, forensisk vetenskap16,17, medicinsk vetenskap18, mineralogi19, och övervakning20. En viktig begränsning av nuvarande fluorescensmikroskop Hyperspektrala avbildningssystem är att standarden Hyperspektrala avbildningsteknik isolerar fluorescens signaler i smala band av 1) först filtrering excitation ljus för att kontrollera prov excitation, sedan 2) ytterligare filtrering avges ljus för att separera fluorescensutsläpp i smala band som senare kan separeras matematiskt21. Filtrering både excitation belysning och utsända fluorescens minskar mängden tillgänglig signal, vilket sänker signal-brus-förhållande och kräver långa förvärvs tider. Den låga signalen och långa förvärvs tider begränsar tillämpligheten av Hyperspektrala avbildning som ett diagnostiskt verktyg.
En bildbehandlings-modalitet har utvecklats som utnyttjar hyperspektral avbildning men ökar den tillgängliga signalen, vilket minskar den nödvändiga förvärvs tiden21,22. Denna nya modalitet, kallad excitation-scanning Hyperspektrala avbildning, förvärvar spektrala bilddata genom att variera excitation våglängd och samla ett brett spektrum av utsläppt ljus. Det har tidigare visats att denna teknik ger order av magnitud ökar i signal-brus-förhållande jämfört med utsläpps skanning tekniker21,22. Ökningen av signal-brus-förhållandet beror till stor del på den breda bandpass (~ 600 Nm) av utsläpps ljus detekteras, medan specificitet tillhandahålls genom filtrering endast excitation ljus i stället för fluorescensutsläpp. Detta gör att alla avgivna ljus (för varje excitation våglängd) för att nå detektorn21. Dessutom kan denna teknik användas för att diskriminera autofluorescence från exogena etiketter. Dessutom minskar förmågan att minska förvärvs tiden på grund av ökad detekterbar signal risken för foto blekning samt möjliggör spektrala skanningar till en förvärvsfrekvens som är godtagbar för spektral video avbildning.
Målet med detta protokoll är att fungera som en datainsamling guide för excitation-scanning Hyperspektrala Imaging mikroskopi. Dessutom ingår beskrivningar som hjälper till att förstå ljusbanan och hårdvaran. Beskrivs också är genomförandet av öppen källkod för en excitation-scanning Hyperspektrala Imaging Mikroskop. Slutligen finns beskrivningar för hur man kalibrerar systemet till en NIST-spårbar standard, justerar program-och maskinvaruinställningar för korrekta resultat och avblandar den upptäckta signalen i bidrag från enskilda komponenter.
Den optimala användningen av excitation-scanning Hyperspektrala Imaging set-up börjar med byggandet av ljusbanan. I synnerhet val av ljuskälla, filter (tunable och Dichroic), filter växling metod och kamera bestämma tillgängliga spektralområdet, möjlig skanningshastighet, detektor känslighet, och rumsliga provtagning. Mercury Arc-lampor erbjuder många excitation våglängd toppar men ger inte en platt spektralutgång och kommer att kräva betydande signal reducering vid utgången toppar för att korrigera spekt…
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja erkänna stöd från NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, och Abraham Mitchell cancer Research Fund.
Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolated from human lung tissues obtained from NDRI | Highly autofluorescent, calcium sensitive cells |
Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Remote-controllable shutter to minimize photobleaching |
Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection. |
Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | For interfacing automated stage with computer and joystick |
Buffer | Made in-house | Made in-house | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3 |
Cell Chamber | ThermoFisher Scientific | Attofluor Cell Chamber, A7816 | Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination |
Excitation Filters | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88) |
Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84) | |
Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83) | |
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78) |
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86) |
GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator |
Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used for accurate measurement of wide-angle illumination |
Inverted Fluorescence Microscope | Nikon Instruments | TE2000 | Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue. |
Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Labels mitochondria |
NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | For verifying appropriate spectral response of the system |
NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Labels cell nuclei |
Objective (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Useful for large fields of view |
Objective (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Most often used for tissue samples |
Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Most often used for cell samples |
sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | For acquiring high-sensitivity digital images |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system |
Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching |
Xenon Arc Lamp | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Lightsource | Light source with relatively uniform spectral output |