निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पर Mecp2 के औषधीय पुनः सक्रियण के लिए एक गैर यादृच्छिक माउस मॉडल
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए गैर यादृच्छिक एक्स गुणसूत्र inactivation के साथ एक व्यवहार्य महिला murine मॉडल उत्पंन, अर्थात्, मातृत्व-वंशानुगत एक्स गुणसूत्र कोशिकाओं के १००% में निष्क्रिय है । हम भी एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए व्यवहार्यता परीक्षण, सहनशीलता, और vivo में निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र के औषधीय पुनः सक्रियण की सुरक्षा ।
Abstract
X गुणसूत्र निष्क्रियण (xci) लिंगों के बीच जीन खुराक संतुलन को प्राप्त करने के लिए महिलाओं में एक एक्स गुणसूत्र के यादृच्छिक मुंह बंद है । नतीजतन, सभी महिलाओं एक्स से जुड़े जीन अभिव्यक्ति के लिए विषमयुग्मज हैं । XCI के प्रमुख नियामकों में से एक Xciहै, जो दीक्षा और xci के रखरखाव के लिए आवश्यक है । पिछले अध्ययनों से 13 ट्रांस अभिनय एक्स गुणसूत्र inactivation कारक (XCIFs) एक बड़े पैमाने पर, समारोह आनुवंशिक स्क्रीन के नुकसान का उपयोग कर की पहचान की है । इस तरह के ACVR1 और PDPK1 के रूप में XCIFs, का निषेध, छोटी हेयरपिन आरएनए या छोटे अणु inhibition का उपयोग, सुसंस्कृत कोशिकाओं में एक्स गुणसूत्र से जुड़े जीन को सक्रिय करता है । लेकिन विवो में निष्क्रिय एक्स क्रोमोसोम को फिर से सक्रिय करने की व्यवहार्यता और सहनशीलता का निर्धारण किया जाना बाकी है । इस लक्ष्य की ओर, एक xistδ: Mecp2/xist: Mecp2-Gfp माउस मॉडल एक एक्स गुणसूत्र पर xist के विलोपन के कारण गैर यादृच्छिक xist के साथ उत्पंन किया गया है । इस मॉडल का उपयोग करना, निष्क्रिय एक्स रिनोवेशन की हद तक xcif inhibitors के साथ उपचार के बाद माउस मस्तिष्क में quantitated था । हाल ही में प्रकाशित परिणाम दिखाने के लिए, पहली बार के लिए, कि xcifs के औषधीय निषेध Mecp2 जीवित माउस मस्तिष्क के वल्कुट ंयूरॉंस में निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र से पुनः सक्रिय ।
Introduction
एक्स क्रोमोसोम इनएक्टिवेशन (XCI) खुराक क्षतिपूर्ति की एक प्रक्रिया है जो एक्स-लिंक्ड जीन एक्सप्रेशन को महिलाओं में एक्स क्रोमोसोम की एक प्रति कोसाइलैंसिंग करके संतुलित करता है | एक परिणाम के रूप में, निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र (Xi) में डीएनए मेथिलन और निरोधात्मक हिस्टोन संशोधनों, जैसे हिस्टोन H3-lysine 27 trimethylation (H3K27me3) और हिस्टोन H2A सर्वव्यापी (H2Aub) सहित विषमवर्णक की विशिष्ट सुविधाओं जमा 2. एक्स गुणसूत्र मुंह बंद के मास्टर नियामक एक्स-inactivation केंद्र (xic) क्षेत्र, लगभग 100 − 500 केबी, जो गिनती और एक्स क्रोमोसोम के युग्मन, inactivation के लिए एक्स गुणसूत्र के यादृच्छिक चयन को नियंत्रित करता है, और दीक्षा और 3क्रोमोसोम के साथ साइलैंसिंग का फैलाव. एक्स inactivation की प्रक्रिया एक्स निष्क्रिय विशिष्ट प्रतिलिपि (Xist) है कि सीआईएस में ग्यारहवीं कोट करने के लिए गुणसूत्र व्यापक मुंह में और फिर से तैयार की तीन आयामी संरचना एक्स गुणसूत्र4के द्वारा शुरू की है । हाल ही में, कई proteomic और आनुवंशिक स्क्रीन xci के अतिरिक्त नियामकों की पहचान की है, जैसे xci के रूप में बातचीत प्रोटीन5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. उदाहरण के लिए, एक निष्पक्ष जीनोम व्यापक आरएनए हस्तक्षेप स्क्रीन का उपयोग कर पिछले एक अध्ययन 13 पारXci कारकों (xcifs)12की पहचान की । यंत्रवत्, XCIFs Xist अभिव्यक्ति को विनियमित और इसलिए, xci समारोह के साथ हस्तक्षेप दोषपूर्ण xसीआई12का कारण बनता है । साथ में, क्षेत्र में हाल ही में अग्रिमों आणविक मशीनरी है कि शुरू करने और XCI बनाए रखने के लिए आवश्यक है में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है ।
Xci नियामकों की पहचान और उनके तंत्र को समझना एक्स-लिंक्ड मानव रोगों, जैसे rett सिंड्रोम (rtt)13,14के लिए सीधे प्रासंगिक है । Rtt एक दुर्लभ neurodevelopmental विकार एक्स में एक विषम युग्मज उत्परिवर्तन की वजह से जुड़े methyl-cpg बाध्यकारी प्रोटीन 2 (MECP2) है कि मुख्य रूप से लड़कियों को प्रभावित करता है15। MECP2 एक्स गुणसूत्र पर स्थित है, क्योंकि rtt लड़कियों ~ ५०% कोशिकाओं जंगली प्रकार व्यक्त करने और ~ ५०% उत्परिवर्ती MECP2व्यक्त करने के साथ MECP2 की कमी के लिए विषम युग्मज हैं । विशेष रूप से, RTT उत्परिवर्ती कोशिकाओं को ग्यारहवीं पर Mecp2 के एक निष्क्रिय लेकिन जंगली प्रकार की प्रतिलिपि, कार्यात्मक जीन है, जो अगर फिर से सक्रिय, संभवतः रोग के लक्षणों को कम कर सकता का एक स्रोत प्रदान हार्बर । RTT के अलावा, वहाँ रहे हैं कई अन्य एक्स से जुड़े मानव रोगों, जिसके लिए ग्यारहवीं के पुनः सक्रियण ऐसे DDX3X सिंड्रोम के रूप में एक संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोण, का प्रतिनिधित्व करता है.
XCIFs का निषेध, 3-फ़ॉसफोनोसिटाइड आश्रित प्रोटीन kinase-1 (PDPK1), और activin एक रिसेप्टर प्रकार 1 (ACVR1), या तो शॉर्ट हेयरपिन आरएनए (एसएचएनए) या छोटे अणु निरोधक द्वारा, Xi-लिंक्ड जीन को पुनः सक्रिय करता है12. ग्यारहवीं से जुड़े जीन के औषधीय पुनः सक्रियण विभिन्न पूर्व vivo मॉडल है कि माउस फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों, वयस्क माउस वल्कुट ंयूरॉंस, माउस भ्रूणीय रेशकोरक, और एक rtt रोगी12से व्युत्पंन फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों को शामिल में मनाया जाता है । तथापि, क्या vivo में ग्यारहवीं से जुड़े जीन के औषधीय पुनर्सक्रियन संभव है कि प्रदर्शन किया जाना है । एक सीमित कारक प्रभावी पशु मॉडल की कमी को सही ढंग से पुनः सक्रिय ग्यारहवीं से जीन की अभिव्यक्ति को मापने के लिए है । इस लक्ष्य की ओर, एक xistδ: Mecp2/xist: Mecp2-gfp माउस मॉडल है कि ग्यारहवीं पर आनुवंशिक रूप से लेबल Mecp2 xist में मातृक एक्स गुणसूत्र16पर विषम युग्मज विलोपन के कारण सभी कोशिकाओं में किया जाता है । इस मॉडल का उपयोग करना, ग्यारहवीं से Mecp2 की अभिव्यक्ति जीवित चूहों के मस्तिष्क में XCIFs inhibitors के साथ उपचार के बाद quantitated किया गया है. यहाँ, xistδ की पीढ़ी : Mecp2/xist: Mecp2-gfp माउस मॉडल और विधि immunofluorescence-आधारित assays हैं का उपयोग कर वल्कुट ंयूरॉंस में quantitate ग्यारहवीं रिनोवेशन करने के लिए वर्णित है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पहले, XCIFs कि चुनिन्दा स्तनधारी महिला कोशिकाओं में ग्यारहवीं से जुड़े जीन के लिए चयन की आवश्यकता है12की पहचान की गई । हम आगे ACVR1 और PDPK1 के बहाव effectors, जो कुशलतापूर्वक ग्यारहवीं माउस फाइकोब्लास्ट सेल ला…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों अभिकर्मक प्रदान करने के लिए एंटोनियो Bedalov धंयवाद; Cryosectioning के लिए वर्जीनिया ऊतक हिस्टोलोजी कोर के विश्वविद्यालय; वर्जीनिया के प्रवाह कोशिका मिति प्रवाह के लिए Cytometry कोर के विश्वविद्यालय के विश्लेषण; जेनोटाइपिंग के साथ तकनीकी सहायता के लिए क्रिश्चियन ब्लू और सलोनी सिंह । इस काम का समर्थन किया गया था एक डबल हू अनुसंधान अनुदान के लिए Z.Z., और एक पायलट परियोजना कार्यक्रम पुरस्कार से वर्जीनिया विश्वविद्यालय-वर्जीनिया टेक बीज कोष पुरस्कार और Hartwell फाउंडेशन व्यक्तिगत जैव चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार के लिए एसबी चव्हाण
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
Riferimenti
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