En ikke-tilfeldig Mouse modell for farmakologisk reaktivering av Mecp2 på inaktiv X-kromosom
Summary
Her beskriver vi en protokoll for å generere en levedyktig kvinnelig murine modell med ikke-tilfeldig X-kromosom inaktive, det vil si at moderskap X-kromosom er inaktiv i 100% av cellene. Vi beskriver også en protokoll for å teste gjennomførbarhet, toleranse og sikkerhet for farmakologisk reaktivering av det inaktive X-kromosom in vivo.
Abstract
X kromosom inaktive (XCI) er tilfeldig demping av ett X-kromosom i kvinner for å oppnå gen dosering balanse mellom kjønnene. Som et resultat, er alle kvinner heterozygot for X-bundet genuttrykk. En av de viktigste regulatorer av XCI er Xist, som er avgjørende for initiering og vedlikehold av XCI. Tidligere studier har identifisert 13 trans fungerende X-kromosom inaktive faktorer (XCIFs) ved hjelp av en stor skala, tap-of-Function genetisk skjerm. Hemming av XCIFs, slik som ACVR1 og PDPK1, ved bruk av kort-eller små molekyl hemmere, reaktiverer X kromosom-tilknyttede gener i kultivert celler. Men gjennomførbarhet og toleranse for reaktivering av inaktive X-kromosom in vivo gjenstår å bestemmes. Mot dette målet har en XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp musemodell blitt generert med ikke-tilfeldige XCI på grunn av sletting av Xist på ett X-kromosom. Ved hjelp av denne modellen, omfanget av inaktive X reaktivering ble quantitated i musen hjernen etter behandling med XCIF-hemmere. Nylig publiserte resultater viser, for første gang, at farmakologisk hemming av XCIFs reaktiverer Mecp2 fra inaktive X-kromosom i kortikale neurons av levende mus hjernen.
Introduction
X kromosom deaktivering (XCI) er en prosess med dosering kompensasjon som balanserer X-bundet genuttrykk ved å stanse en kopi av X-kromosom i kvinner1. Som et resultat, den inaktive X-kromosom (XI) akkumulerer karakteristiske trekk ved heterochromatin inkludert DNA metylering og hemmende histone modifikasjoner, for eksempel histone H3-lysin 27 trimethylation (H3K27me3) og histone H2A ubiqitinering (H2Aub) 2. The Master regulator av x-kromosom deaktivering er x-deaktivering Center (Xic) regionen, rundt 100 − 500 kB, som styrer telling og sammenkobling av x-kromosomer, tilfeldig valg av x-kromosom for inaktive, og initiering og spredning av demping langs X-kromosom3. Prosessen med X inaktive er initiert av X inaktiv spesifikk transkripsjon (Xist) som strøk XI i CIS for å megle kromosom hele stanse og renovere den tredimensjonale strukturen i X-kromosom4. Nylig har flere Proteomikk og genetiske skjermer identifisert flere regulatorer av XCI, sliksom Xist samspill proteiner5,6,7,8,9 , 10 andre , 11 flere , 12. for eksempel, en tidligere studie ved hjelp av en upartisk Genova-Wide RNA forstyrrelser skjermen identifisert 13 trans-fungerende XCI faktorer (XCIFs)12. Mechanistically, XCIFs regulere Xist uttrykk og derfor forstyrrer XCIFs funksjonen forårsaker defekt XCI12. Sammen har nylige fremskritt i feltet gitt viktig innsikt i molekyl maskineriet som kreves for å initiere og vedlikeholde XCI.
Identifisering av XCI regulatorer og forstå deres mekanisme i XCI er direkte relevant for X-tilknyttede menneskelige sykdommer, som rett syndrom (RTT)13,14. RTT er en sjelden neurodevelopmental lidelse forårsaket av en heterozygot mutasjon i X-tilknyttede metyl-CpG bindende protein 2 (MECP2) som rammer overveiende jenter15. Fordi MECP2 ligger på X-KROMOSOM, RTT jenter er heterozygot for MECP2 mangel med ~ 50% celler uttrykker vill-type og ~ 50% uttrykker mutant MECP2. Spesielt RTT mutant celler havn en sovende men vill-type kopi av Mecp2 på XI, som gir en kilde til funksjonell genet, som hvis reaktivert, potensielt kan lindre symptomer på sykdommen. I tillegg til RTT, er det flere andre X-tilknyttede menneskelige sykdommer, som reaktivering av XI representerer en potensiell terapeutisk tilnærming, for eksempel DDX3X syndrom.
Hemming av XCIFs, 3-fosfoinositid avhengige protein kinase-1 (PDPK1), og activin A reseptor type 1 (ACVR1), enten ved korte hæler RNA (shRNA) eller små molekyl hemmere, reaktiverer XI-koblede gener12. Farmakologisk reaktivering av XI-tilknyttede gener er observert i ulike ex vivo-modeller som inkluderer muse Fibroblast cellelinjer, voksen mus kortikale neurons, mus embryonale fibroblaster, og Fibroblast cellelinjer avledet fra en RTT pasient12. Men hvorvidt farmakologisk reaktivering av XI-koblede gener er gjennomførbart i vivo gjenstår å bli demonstrert. En begrensende faktor er mangelen på effektive dyremodeller for å nøyaktig måle uttrykk for gener fra reaktivert XI. Mot dette målet, en XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp mus modellen har blitt generert som bærer en genetisk merket Mecp2 på XI i alle cellene på grunn av heterozygot sletting i Xist på mors X-kromosom16. Ved hjelp av denne modellen har uttrykket Mecp2 fra Xi blitt quantitated etter behandling med XCIFs-hemmere i hjernen til levende mus. Her beskrives genereringen av XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp musemodell og metodikk for å quantitate XI reaktivering i kortikale neurons med immunofluorescence-baserte analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere identifiserte XCIFs som er selektivt nødvendige for å stanse av XI-koblede gener i pattedyr kvinnelige celler,12. Vi videre optimalisert potente små molekyl hemmere å målrette XCIFs, slik som ACVR1 og nedstrøms effekt Orer av PDPK1, som effektivt reaktivere XI-koblet Mecp2 i mus Fibroblast cellelinjer, mus kortikale neurons, og en menneskelig Fibroblast celle linje avledet fra en RTT-pasient. Disse resultatene tyder på at XI reaktivering er en sannsynlig terapeutisk tiln?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Antonio Bedalov for å gi reagenser; University of Virginia tissue histologi kjerne for kryosnitt; University of Virginia Flow flowcytometri Core for Flow flowcytometri analyse; Christian Blue og saloni Singh for teknisk assistanse med genotyperingteknologi. Dette arbeidet ble støttet av en Double hoo Research Grant til Z.Z., og en pilot Project program Award fra University of Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award og Hartwell Foundation Individual Biomedical Research Award til S.B.
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
Riferimenti
- Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).
- Pontier, D. B., Gribnau, J. Xist regulation and function explored. Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).
- Barnes, C., Kanhere, A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).
- Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
- Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1). Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).
- Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome. Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).
- Anvret, M., Wahlstrom, J. Rett syndrome: random X chromosome inactivation. Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).
- Przanowski, P., et al. Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice. Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).
- Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
