Здесь мы описываем протокол для создания жизнеспособной женской модели Мурины с неслучайной инактивации х-хромосомы, т. е., унаследованная по наследству х-хромосома неактивна в 100% клеток. Мы также описываем протокол для проверки осуществимости, переносимости и безопасности фармакологической активации неактивной х-хромосомы в естественных условиях.
X-хромосома инактивации (XCI) является случайный глушителей одной х-хромосоме у женщин для достижения баланса гена дозировки между полами. В результате, все самки гетерозиготные для X-сцеженный экспрессии генов. Одним из ключевых регуляторов XCI является Xci, который имеет важное значение для инициирования и поддержания xci. Предыдущие исследования выявили 13 транс действующих факторов инактивации X хромосом (XCIFs), используя крупномасштабные, потери функции генетического экрана. Ингибирование XCIFs, таких как ACVR1 и PDPK1, используя короткую шпильку РНК или малых ингибиторов молекул, активирует X хромосома связаны генов в культивируемых клеток. Но осуществимость и переносимость повторного активации неактивной х-хромосомы в естественных условиях еще предстоит определить. К этой цели, модель мыши ксистδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP была сгенерированный с non-случайным Xist из-за удаления Xist на одной X хромосоме. При использовании этой модели степень неактивного X реактивации была количественно в мозге мыши после лечения ингибиторами КСИФ. Недавно опубликованные результаты показывают, впервые, что Фармакологическое торможение XCIFs активирует Mecp2 из неактивной х-хромосомы в корковых нейронами мозга живого мыши.
X-хромосома инактивации (XCI) является процесс дозировки компенсации, которая уравновешивает X-сцеженно экспрессии генов, глушителей одной копии х-хромосоме у самок1. В результате неактивная х-хромосома (XI) накапливает характерные особенности гетьхроматина, включая метилирование ДНК и ингибирующие гистоун модификации, такие как гистоун Н3-лизин 27 триметилирования (H3K27me3) и гистоун Н2А убиквителинация (H2Aub) 2. Мастер регулятор глушителей x-хромосомы является x-инактивации центр (XIC) область, вокруг 100 − 500 КБ, который контролирует подсчет и спаривание х-хромосом, случайный выбор х-хромосомы для инактивации, и инициирования и распространение глушителей по X хромосоме3. Процесс х инактивации инициируется X неактивные конкретные Стенограмма (Xist), что пальто XI в СНГ , чтобы посредничать хромосомы всей глушителей и переделывать трехмерную структуру х-хромосоме4. В последнее время несколько протеомических и генетических экранов выявили дополнительные регуляторы xci, такие как xci взаимодействующие белки5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. Например, в предыдущем исследовании с использованием беспристрастного генома на экране РНК-интерференции были определены 13 трансдействующих факторов Xci (xcifs)12. Механистично, XCIFs регулирует Xist выражение и поэтому, вмешиваясь в функции xcifs вызывает ДЕФЕКТНЫЙ xci12. В совокупности недавние достижения в этой области обеспечили важное понимание молекулярного механизма, необходимого для инициирования и поддержания XCI.
Идентификация регуляторов xci и понимание их механизма в xci напрямую связаны с х-связанными заболеваниями человека, такими как синдром Ретта (RTT)13,14. RTT является редким нейроразвития расстройство вызвано гетерозиготной мутации в X-связанной метил-CpG связывающий белок 2 (MECP2), который затрагивает преимущественно девочек15. Потому что MECP2 находится на х-хромосоме, RTT девушки гетерозиготных для MECP2 дефицита с ~ 50% клеток, выражающих дикого типа и ~ 50% выражения мутант MECP2. Примечательно, что клетки мутанта RTT гавани спящие, но дикого типа копия Mecp2 на XI, обеспечивая источник функционального гена, который, если возобновлена, потенциально может облегчить симптомы болезни. В дополнение к RTT, есть несколько других х-связанных заболеваний человека, для которых реактивации XI представляет потенциальный терапевтический подход, таких как синдром DDX3X.
Ингибирование XCIFs, 3-фосфоиноситиде зависимых протеинкиназы-1 (PDPK1), и Активо рецептор типа 1 (ACVR1), либо короткой РНК-шпилька (Шрана), либо малых ингибиторов молекул, активирует XI-сцеживание генов12. Фармакологическая Реактивация XI связанных генов наблюдается в различных бывших моделях в естественных условиях, которые включают клеточные линии фиброза мыши, Взрослый корковых нейронов мыши, мышь эмбриональных фибробласты, и фиброза клеточных линий, полученных от пациента RTT12. Однако, является ли Фармакологическое возобновление XI связанных генов возможно в естественных условиях еще предстоит продемонстрировать. Одним из ограничивающих факторов является отсутствие эффективных моделей животных, позволяющих точно измерить экспрессию генов у активированным XI. К этой цели, ксистδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP мышь модель была сгенерирована, что несет генетически помечены Mecp2 на XI во всех клетках из-за гетерозиготного удаления в Xist на материнской X хромосоме16. С помощью этой модели, выражение Mecp2 из XI было кванцирован после лечения ингибиторами XCIFs в мозге живых мышей. Здесь описывается генерация модели мыши ксистδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP и методология Квантета Си реактивации в корковых нейронами с использованием метода иммунофлуоресцентного анализа.
Ранее, XCIFs, которые выборочно необходимы для глушителей XI связанных генов в млекопитающих женских клеток были выявлены12. Мы дополнительно оптимизированы мощные малые ингибиторы молекул целевой XCIFs, таких, как ACVR1 и вниз по течению эффекторы PDPK1, который эффективно активиров…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Антонио Бедалов за предоставление реагентов; Университет Вирджинии ткань гистологии ядро для криосекционирования; Университет Вирджинии поток Цитометрическая основа для анализа потока цитометрии; Кристиан Блю и Салони Сингх за техническую помощь в генотипирования. Эта работа была поддержана Грант двойного Ху исследований в З.З., и Пилотная программа премии проекта от Университета Вирджинии-Вирджиния Tech семенной фонд премии и Хартвелл фонда индивидуальные биомедицинских исследований премии С.Б.
MICE | |||
Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
REAGENTS | |||
22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
7-AAD | BioLegend | 420403 | |
ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
BSA | Promega | R396D | |
Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
citric acid | Sigma | C-1857 | |
DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
lodixanol | Sigma | 1343517 | |
magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
PCR mix | |||
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
scalpel blades | |||
Shallow glass or plastic tray | |||
skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
EQUIPMENT | |||
Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
BD FACScalibur | |||
centrifuge | |||
glass homogenizer | |||
cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
Leica 3050S research cryostat | |||
stereotactic platform | |||
thermocycler | |||
Timer | |||
ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |