Un modello di mouse non casuale per la riattivazione farmacologica di MECP2 sul cromosoma X inattivo

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per generare un modello murino femminile vitale con inattivazione cromosomico X non casuale, cioè il cromosoma X ereditato dalla materna è inattivo nel 100% delle cellule. Descriviamo anche un protocollo per testare la fattibilità, la tollerabilità e la sicurezza della riattivazione farmacologica del cromosoma X inattivo in vivo.

Abstract

X inattivazione cromosoma (XCI) è il silenziamento casuale di un cromosoma X nelle femmine per raggiungere l'equilibrio di dosaggio genico tra i sessi. Di conseguenza, tutte le femmine sono eterozigoti per l'espressione genica legata alla X. Uno dei regolatori chiave di XCI è XIST, che è essenziale per l'avvio e la manutenzione di XCI. Studi precedenti hanno identificato 13 fattori di inattivazione del cromosoma X Trans-azione (XCIFs) utilizzando uno schermo genetico su larga scala e perdita di funzione. L'inibizione degli Xcif, come ACVR1 e PDPK1, mediante l'utilizzo di RNA a breve tornante o di piccoli inibitori delle molecole, riattiva i geni collegati al cromosoma X nelle cellule coltivate. Ma la fattibilità e la tollerabilità di riattivare il cromosoma X inattivo in vivo rimane da determinare. Verso questo obiettivo, un modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP è stato generato con XCI non casuali a causa della cancellazione di XIST su un cromosoma X. Utilizzando questo modello, l'estensione della riattivazione X inattiva è stata quantitata nel cervello del topo dopo il trattamento con inibitori XCIF. I risultati recentemente pubblicati mostrano, per la prima volta, che l'inibizione farmacologica di XCIFs riattiva MECP2 dal cromosoma X inattivo nei neuroni corticali del cervello del topo vivente.

Introduction

L'inattivazione cromosoma x (XCI) è un processo di compensazione del dosaggio che bilancia l'espressione genica legata all'X silenziando una copia del cromosoma X nelle femmine¹. Di conseguenza, il cromosoma X inattivo (XI) accumula le caratteristiche tipiche dell'eterocromatina, inclusa la metilazione del DNA e le modifiche dell'istone inibitorio, come l'istone H3-lisina 27 trimetilazione (H3K27me3) e l'istone H2A ubiquitinazione (H2Aub) ². il regolatore principale del silenziamento cromosomico x è la regione del centro di inattivazione x (XIC), intorno a 100 − 500 KB, che controlla il conteggio e l'accoppiamento dei cr....

Protocol

Il lavoro che coinvolge i topi è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia (IACUC; #4112).

1. generare un modello di mouse XCI non casuale con MECP2 geneticamente etichettato su Xi

Nota: Ceppi di topo utilizzati nello studio sono stati i seguenti: MECP2-GFP/MECP2-GFP (MECP2^{TM 3.1 uccello}, tabella dei materiali) e XIST/δxist (B6; 129-XIST < tm5Sado >; fornito da Antonio bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle). Le strategie di allevamento tra i rispettivi ceppi sono st....

Results

Per dimostrare la fattibilità del modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP per gli studi di riattivazione XI, la riattivazione xcif inibitore-mediata di XI-Linked MECP2-GFP è stata testata nei fibroblasti embrionali di topo (MEFs). I MEF femminili sono stati isolati dal giorno 15,5 Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP embrioni come descritto nella sezione 3 (Figura 1a). I genotipi di Xistδ femminile: MECP2/XIST: MECP2-GFP MEFs sono stati c.......

Discussion

In precedenza, gli Xcif che sono selettivamente necessari per il silenziamento dei geni collegati a Xi nelle cellule femminili di mammiferi sono stati identificati¹². Abbiamo ulteriormente ottimizzato potenti inibitori di piccole molecole per indirizzare gli Xcif, come ACVR1 e gli effettori a valle di PDPK1, che riattivano in modo efficiente i MECP2 collegati a Xi nelle linee cellulari di fibroblasti del topo, i neuroni corticali del topo e una cellula fibroblastica umana una linea deriva.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICE
Mecp2tm3.1Bird	Il laboratorio Jackson	#014610
B6; 129-Xist (tm5Sado)	fornito da Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle
REAGENTI
22x22 mm vetrino coprioggetti	FISHERfinest (Fisher Scientific)	125488
32% Paraformaldeide	Microscopia Elettronica Sciences	15714-S
Siringa da 50 ml	Medline Industries	NPMJD50LZ
piastra di coltura da 60 mm	CellStar	628160
7-AAD	BioLegend	420403
cloruro di ammonio (NH4Cl)	Fisher Chemical	A661-3
anti-GFP-AlexaFluor647	Invitrogen	A-31852
anti-MAP2	Aves Labs	MAP
BSA	Promega	R396D
Buprenorfina SR	Zoopharm
acido citrico	Sigma	C-1857
DMSO	Fisher Bioreagents	BP231-100
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Ethanol	Decon Labs	2701
fetal bovine serum (FBS)	VWR Life Science	89510-198
gelatina	Sigma-Aldrich	G9391
vetrini	Fisherbrand	22-034-486
capra anti-pollo FITC-marcato anticorpo secondario Aves	Labs	F-1005
GSK650394	ApexBio	B1051
hamilton 10μ l siringa	Hamilton Sigma-Aldrich	28615-U
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-092
Ketamine	Ketaset	NDC 0856-2013-01
Forbici curve smussate / smussate grandi Fine	Science Tools	14519-14
LDN193189	Cayman Chemicals	11802
lodixanol	Sigma
cloruro di magnesio (MgCl2)	Fisher Chemical	M35-212
Metilcelulosio	Sigma	M0262-100G
terreno di montaggio con	Vectashield	H-1200
, 26 GA x 1,25"	PrecisionGlide	305111
unguento oftalmico	Refresh Lacri-Lube	93468
temperatura di taglio ottimale (O.C.T.)	ThermoFisher
PCR mix
Penicillina/Streptomicina (Pen/Streptomyc)	Corning	30-002-Cl
Soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4 (PBS)	Corning Cellgro	46-103-CM
Cloruro di potassio (KCl)	Fisher Scientific	P330-500
lame
per bisturiVassoio
colla per la pelle/adesivo per tessuti	3M Vetbond	1469SB
azoturo di sodio	Fisher Scientific	CAS 26628-22-8
Cloruro di sodio (NaCl)	Fisher Chemical	S642-212
pinza emostatica standard	Fine Science Tools	13013-14
Pinzetta standard	Fine Science Tools	11027-12
Forbici per iride diritte	Fine Science Tools	14058-11
saccarosio	Fisher Scientific	BP220-1
Tris-base	Fisher Bioreagents	BP152-5
Triton X-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tripsina-EDTA	Gibco	15400-054
Xilazina	Akorn	NDC: 59399-111-50
ATTREZZATURA
Zeiss AxioObserver Microscopio per cellule vive	Zeiss	Zeiss Zeiss AxioObserver
fresa da 0,45 mm	IDEAL MicroDrill	67-1000
BD FACScalibur
omogeneizzatore
incubatore per coltura cellulare	Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i	13-998-213
Leica 3050S criostato
piattaforma
termociclatore
Timer
ultracentrifuga	Beckman Coulter Optima L-100 XP
Bagno d'acqua (37 º C)	Fisher Scientific Isotemp 2239