Améliorer l'engraftment des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme par l'intermédiaire d'une inhibition transitoire de l'activité de Rho Kinase
Summary
Dans ce protocole, nous démontrons et élaborons sur la façon d’utiliser les cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour la différenciation et la purification des cardiomyocytes, et en outre, sur la façon d’améliorer son efficacité de transplantation avec l’inhibiteur de kinase de protéine Rho-associé prétraitement dans un modèle d’infarctus du myocarde de souris.
Abstract
Un facteur crucial dans l’amélioration de l’efficacité de la thérapie cellulaire pour la régénération myocardique est d’augmenter en toute sécurité et efficacement le taux d’engraftment cellulaire. Y-27632 est un inhibiteur très puissant de la kinase de protéine rho-associée, enroulée-contenante de cire (RhoA/ROCK) et est employé pour empêcher l’apoptose de cellules dissociation-induite (anoikis). Nous démontrons que le prétraitement de Y-27632 pour les cardiomyocytes pluripotents induits par l’homme de cellules souches (hiPSC-CMs‘RI)avant l’implantation a comme conséquence une amélioration de taux d’engraftment de cellules dans un modèle de souris de l’infarctus aigu du myocarde (MI). Ici, nous décrivons une procédure complète de différenciation, de purification, et de prétraitement cellulaire de hiPSC-CMs avec Y-27632, aussi bien que la contraction cellulaire résultante, les mesures transitoires de calcium, et la transplantation dans les modèles de MI de souris. La méthode proposée fournit une méthode simple, sûre, efficace et peu coûteuse qui augmente considérablement le taux d’engraftment cellulaire. Cette méthode ne peut pas seulement être utilisée en conjonction avec d’autres méthodes pour améliorer davantage l’efficacité de la transplantation cellulaire, mais fournit également une base favorable pour l’étude des mécanismes d’autres maladies cardiaques.
Introduction
Les thérapies à base de cellules souches ont montré un potentiel considérable comme traitement pour les dommages cardiaques causés par MI1. L’utilisation de hiPSC différenciés fournit une source inépuisable de hiPSC-CMs2 et ouvre la porte au développement rapide de traitements révolutionnaires. Cependant, de nombreuses limitations à la traduction thérapeutique demeurent, y compris le défi du taux d’engraftment sévèrement bas des cellules implantées.
Dissociation des cellules avec trypsine initie anoikis3, qui n’est accélérée qu’une fois que ces cellules sont injectées dans des environnements difficiles comme le myocarde ischémique, où l’environnement hypoxique accélère le cours vers la mort cellulaire. Parmi les cellules restantes, une grande proportion est lavée du site d’implantation dans la circulation sanguine et répandue dans toute la périphérie. L’une des principales voies apoptotiques est la voie RhoA/ROCK4. Basé sur des recherches antérieures, la voie RhoA/ROCK régule l’organisation cytosquelettique actine5,6, qui est responsable du dysfonctionnement cellulaire7,8. L’inhibiteur ROCK Y-27632 est largement utilisé lors de la dissociation et de la passification somatiques et des cellules souches, pour augmenter l’adhérence cellulaire et réduire l’apoptose cellulaire9,10,11. Dans cette étude, Y-27632 est utilisé pour traiter les hiPSC-CMs avant la transplantation dans une tentative d’augmenter le taux d’engraftment cellulaire.
Plusieurs méthodes visant à améliorer le taux d’engraftment cellulaire, telles que le choc thermique et le revêtement de matrice de membrane de sous-sol12,ont été établies. Mis à part ces méthodes, la technologie génétique peut également favoriser la prolifération des cardiomyocytes13 ou inverser les cellules nonmyocardiques en cardiomyocytes14. Du point de vue de la bioingénierie, les cardiomyocytes sont ensepépins sur un échafaudage biomatériau pour améliorer l’efficacité de la transplantation15. Malheureusement, la majorité de ces méthodes sont compliquées et coûteuses. Au contraire, la méthode proposée ici est simple, rentable et efficace, et elle peut être utilisée comme traitement basal avant la transplantation, ainsi que dans la conjugaison avec d’autres technologies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les principales étapes de cette étude comprennent l’obtention de l’hiPSC-MC pur, l’amélioration de l’activité des hiPSC-MC par le prétraitement Y-27632, et enfin, la transplantation d’une quantité précise de hiPSC-MC dans un modèle MI souris.
Les principaux problèmes abordés ici étaient que, d’abord, nous avons optimisé les méthodes de purification sans glucose19 et mis en place un nouveau système de purification efficace. La procédure du système compren…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Joseph C. Wu (Université Stanford) d’avoir aimablement fourni la construction Fluc-GFP et le Dr Yanwen Liu pour l’excellente assistance technique. Cette étude est soutenue par les subventions RO1 des National Institutes of Health HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (à J.Z.), et HL121206A1 (à L.Z.), et une subvention R56 HL142627 (à W.Z.), une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association 16SDG30410018, et l’Université de l’Alabama à Birmingham Faculty Development Grant (à W.Z.).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
Riferimenti
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