Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, School of Engineering,University of Alabama at Birmingham, 2Division of Cardiovascular Diseases, School of Medicine, School of Engineering,University of Alabama at Birmingham, 3Department of Cardiac Surgery,The Second Xiangya Hospital of Central South University
Summary
このプロトコルでは、ヒト誘導多能性幹細胞を心筋細胞の分化および精製に使用する方法をデモンストレーションし、さらに、Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤による移植効率を改善する方法について説明します。マウス心筋梗塞モデルにおける前処理。
Abstract
心筋再生の細胞療法の有効性を改善する上で重要な要因は、安全かつ効率的に細胞の生着率を高めることです。Y-27632は、Rho-関連のコイルコイル含有タンパク質キナーゼ(RhoA/ROCK)の非常に強力な阻害剤であり、解離誘発性細胞アポトーシス(アノイキス)を防ぐために使用されます。移植前にヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM+RI)に対するY-27632前処理が、急性心筋梗塞(MI)のマウスモデルにおける細胞移植率の向上をもたらすことを実証する。ここでは、Y-27632によるhiPSC-PM分化、精製、細胞前処理の完全な手順と、得られた細胞収縮、カルシウム過渡測定、マウスMIモデルへの移植について説明する。提案された方法は、細胞の生着率を大幅に増加させるシンプルで安全で効果的で低コストの方法を提供します。この方法は、細胞移植効率をさらに高めるために他の方法と組み合わせて使用するだけでなく、他の心臓疾患のメカニズムの研究のための有利な基礎を提供します。
Introduction
幹細胞ベースの治療法は、MI1によって引き起こされる心臓損傷の治療薬としてかなりの可能性を示している。差別化されたhiPSCの使用はhiPSC-CM2の無尽蔵の源を提供し、画期的な処置の急速な発展のためのドアを開く。しかしながら、移植細胞の移植率が著しく低い課題を含む治療翻訳には多くの制限が残っている。
トリプシンとの解離細胞は、低酸素環境が細胞死に向かう過程を加速する虚血性心筋のような過酷な環境に注入された後にのみ加速されるアノイキス3を開始する。残りの細胞のうち、大部分は移植部位から血流に洗い流され、周辺に広がる。主要なアポトーシス経路の1つは、RhoA/ROCK経路4です。以前の研究に基づいて、RhoA/ROCK経路は、細胞機能障害7、8を担当するアクチン細胞骨格組織5、6を調節する。ROCK阻害剤Y-27632は、体細胞および幹細胞の解離および通過時に広く使用され、細胞接着性を高め、細胞アポトーシス9、10、11を減少させる。本研究では、Y-27632は移植前のhiPSC-CMを治療し、細胞生着率を高めるために用いられる。
ヒートショックや基体膜マトリックスコーティング12など、細胞生着速度の向上を目的としたいくつかの方法が確立されている。これらの方法とは別に、遺伝技術はまた、心筋細胞増殖13を促進するか、または心筋細胞14に非筋細胞を逆転させることができる。バイオエンジニアリングの観点から、心筋細胞は、移植効率を向上させるために生体材料足場に播種される15.残念ながら、これらの方法の大半は複雑でコストがかかります。それどころか、ここで提案される方法は、シンプルで費用対効果が高く、効果的であり、移植前の基礎治療や他の技術との結合としても使用できます。
Protocol
この研究のすべての動物の手順は、バーミンガムのアラバマ大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、国立衛生研究所動物ケアおよび使用ガイドライン(NIH出版No.)に基づいていました。85-23)。 1. 培養メディア・文化プレートの作成 中程度の準備 hiPSC培地の場合は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)基底培地(材料表1)の400…
Representative Results
この研究で使用されるhiPSC-PMは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を持つヒト起源に由来した。従って、生体内移植細胞の生存率は、生物発光イメージング(BLI)17(図1A、B)により検出した。組織学的心臓切片については、ヒト特異的心臓トロポニンT(hcTnT)およびヒト核抗原(HNA)二重陽性細胞を生着生hiPSC-COM(<strong class="x…
Discussion
本研究の主なステップは、純粋なhiPSC-PMの取得、Y-27632前処理によるhiPSC-PMの活性の向上、そして最後に、正確な量のhiPSC-PMをマウスMIモデルに移植することである。
ここで取り上げられた主な問題は、まず、グルコースフリー精製方法19を最適化し、新規の効率的な精製システムを確立したことです。システム手順には、細胞解離酵素の適用、ゼラチンコ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Fluc-GFPコンストラクトを親切に提供してくれたジョセフ・C・ウー博士(スタンフォード大学)とヤンウェン・リウ博士に優れた技術支援を提供してくれたことに感謝しています。この研究は、米国国立衛生研究所RO1助成金HL95077、HL114120、HL131017、HL138023、UO1 HL134764(J.Z.)、およびHL121206A1(L.Z.)、およびR56助成金HL142627(米国科学者への)によってサポートされています。16SDG30410018、およびバーミンガム教員開発助成金(W.Z.)のアラバマ大学。
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Zhao, M., Tang, Y., Ernst, P. J., Kahn-Krell, A., Fan, C., Pretorius, D., Zhu, H., Lou, X., Zhou, L., Zhang, J., Zhu, W. Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity. J. Vis. Exp. (149), e59452, doi:10.3791/59452 (2019).