Förbättra inympningen av humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda Kardiomyocyter via en övergående hämning av Rho-Kinas aktivitet
Summary
I detta protokoll visar och utvecklar vi hur man använder humana inducerade pluripotenta stamceller för kardiomyocyte differentiering och rening, och vidare, om hur man kan förbättra sin transplantation effektivitet med Rho-associerad proteinkinashämmare förbehandling i en mus hjärtinfarkt modell.
Abstract
En avgörande faktor för att förbättra cellulära terapi effektivitet för myokardiell förnyelse är att säkert och effektivt öka cell inympning hastighet. Y-27632 är en mycket potent hämmare av Rho-associerade, lindade-Coil-innehållande proteinkinas (RhoA/ROCK) och används för att förhindra dissociation-inducerad Cell apoptos (Anoikis). Vi visar att Y-27632 förbehandling för humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs+ RI) före implantation resulterar i en cell engrafations hastighet förbättring i en musmodell av akut hjärtinfarkt (mi). Här beskriver vi ett komplett förfarande av hiPSC-CMs differentiering, rening, och cell förbehandling med Y-27632, samt den resulterande cellkontraktion, kalcium övergående mätningar, och transplantation till mus MI modeller. Den föreslagna metoden ger en enkel, säker, effektiv och låg kostnad metod som avsevärt ökar cell inympningsgraden. Denna metod kan inte bara användas tillsammans med andra metoder för att ytterligare förbättra cell transplantations effektiviteten utan ger också en gynnsam grund för studiet av andra hjärtsjukdomar.
Introduction
Stamcells-baserade terapier har visat stor potential som en behandling för hjärtskador orsakade av MI1. Användningen av differentierade hiPSCs ger en outtömlig källa av hiPSC-CMs2 och öppnar dörren för den snabba utvecklingen av genombrott behandlingar. Emellertid, många begränsningar till terapeutisk översättning kvarstår, inklusive utmaningen att den kraftigt låga inympningar graden av implanterade celler.
Separera celler med trypsin initierar Anoikis3, som bara accelereras när dessa celler injiceras i hårda miljöer som den ischemiska myocardium, där hypoxisk miljö accelererar kursen mot celldöd. Av de kvarvarande cellerna tvättas en stor del ut från implantationsstället in i blodomloppet och sprids i periferin. En av de viktigaste apoptotiska vägar är RhoA/ROCK Pathway4. Baserat på tidigare forskning, den RhoA/rock Pathway reglerar aktin cytoskeletala organisationen5,6, som ansvarar för cell dysfunktion7,8. Berg hämmaren Y-27632 används flitigt under somatiska och stamcells dissociation och passaging, för att öka celladhesion och minska Cell apoptos9,10,11. I denna studie, Y-27632 används för att behandla hiPSC-CMs före transplantation i ett försök att öka cell inympning hastighet.
Flera metoder som syftar till att förbättra cell inympnings frekvens, såsom värme chock och basalmembran matris beläggning12, har fastställts. Bortsett från dessa metoder, genetisk teknik kan också främja kardiomyocyte proliferation13 eller omvänd nonmyokardiserade celler i kardiomyocyter14. Ur bioteknik perspektiv, kardiomyocyter är seedade på en biomaterial byggnadsställning för att förbättra transplantationen effektivitet15. Tyvärr är de flesta av dessa metoder komplicerade och kostsamma. Tvärtom, den metod som föreslås här är enkel, kostnadseffektiv och effektiv, och den kan användas som en basal behandling före transplantation, liksom i konjugering med andra tekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
De viktigaste stegen i denna studie inkluderar att få ren hiPSC-CMs, förbättra aktiviteten av hiPSC-CMs genom Y-27632 förbehandling, och slutligen, transplantation en exakt mängd hiPSC-CMs i en mus MI modell.
De viktigaste frågorna som togs upp här var att vi först optimerade de glukos fria renings metoderna19 och upprättade ett nytt effektivt reningssystem. Systemet förfarande ingår tillämpa cell-dissociation enzymer, återplantering celler i gelatin-belagd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr Joseph C. Wu (Stanford University) för vänligt tillhandahållande av Fluc-GFP konstruera och Dr Yanwen LiU för utmärkt tekniskt bistånd. Denna studie stöds av National Institutes of Health RO1 Grants HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (till J.Z.), och HL121206A1 (till L.Z.), och en R56 Grant HL142627 (till W.Z.), en amerikansk hjärt förening vetenskapsman Development Grant 16SDG30410018, och University of Alabama vid Birmingham fakultetens Utvecklingsstipendium (till W.Z.).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
Riferimenti
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
