Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması
Summary
Bu protokolde, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin kardiyomiyosit farklılaşma ve arıtma için nasıl kullanılacağı ve daha fazla, Rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü ile transplantasyon verimliliğini nasıl iyileştirebileceğini gösteriyoruz. bir fare miyokard infarktüsü modelinde ön tedavi.
Abstract
Miyokard rejenerasyon için hücresel terapi etkinliğini iyileştirmek için önemli bir faktör güvenli ve verimli hücre Engraftman hızını artırmak için. Y-27632, Rho ile ilişkili, helezon-bobin içeren protein kinaz (RhoA/ROCK) ve dissosyasyon kaynaklı hücre apoptozis (anoikis) önlemek için kullanılan son derece güçlü bir inhibitörü. Biz, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler (hipsc-CMS+ RI) için Y-27632 ön tedavisinin, akut miyokard infarktüsü (mı) fare modelinde bir hücre Engraftman oranı iyileştirmesinde implantasyon sonuçlarından önce olduğunu gösteriyoruz. Burada, Y-27632 ile hiPSC-CMs farklılaşma, arıtma ve hücre ön tedavi prosedürlerinin yanı sıra elde edilen hücre kasılma, kalsiyum geçici ölçümleri ve fare mı modellerinde transplantasyon gibi tam bir prosedür açıklanmaktadır. Önerilen yöntem, hücre Engraftman hızını önemli ölçüde artıran basit, güvenli, etkili ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Bu yöntem sadece daha fazla hücre transplantasyonu verimliliğini artırmak için diğer yöntemlerle birlikte kullanılamaz, aynı zamanda diğer kardiyak hastalıkların mekanizmalarının çalışması için de olumlu bir temel sağlar.
Introduction
Kök hücre bazlı tedaviler, mı1 ‘in neden olduğu kardiyak hasarlara yönelik bir tedavi olarak önemli bir potansiyel göstermiştir. Farklılaşan hiPSCs kullanımı, hiPSC-CMs2 ‘ nin tükenmeyen bir kaynağını sağlar ve çığır açan tedavilerin hızlı gelişimi için kapıyı açar. Ancak, implante edilen hücrelerin ciddi derecede düşük Engraftman oranının zorluk da dahil olmak üzere, terapötik çeviri için birçok sınırlama kalır.
Tripsin ile hücreleri ayırmak anoikis başlatır3, hangi sadece bu hücreler iskemik miyokard gibi sert ortamlar enjekte edildikten sonra hızlandırılmış, hipotik çevre hücre ölümü doğru kurs hızlandırır nerede. Kalan hücrelerin büyük bir oranı, implantasyon bölgesinden kan dolaşımına kadar yıkanır ve çevre boyunca yayılır. Anahtar apoptotik yollarından biri RhoA/kaya yolu4. Önceki araştırmaya dayanarak, rhoa/rock yolu hücre disfonksiyon7, 8sorumludur aktin sitroiskelet organizasyonu5,6, düzenler. Kaya inhibitörü Y-27632 yaygın olarak somatik ve kök hücre dağılma ve geçiş sırasında kullanılır, hücre yapışmasını artırmak ve hücre apoptozis azaltmak için9,10,11. Bu çalışmada, Y-27632, hipsc-CMS ‘ i transplantasyondan önce tedavi etmek için, hücre Engraftman hızını artırma girişimi için kullanılır.
Isı şok ve Bodrum membran matris kaplama12gibi hücre Engraftman hızını artırmaya yönelik çeşitli yöntemler kurulmuştur. Bu yöntemlerin yanı sıra, genetik teknoloji kardiyomiyosit proliferasyonu13 veya ters nonmiyokard hücrelerini kardiyomiyositlere14olarak teşvik edebilir. Biyomühendislik perspektifinden, kardiyomiyositler transplantasyon verimliliğini artırmak için biyomateryal iskele üzerine dikilir15. Ne yazık ki, bu yöntemlerin çoğunluğu karmaşık ve pahalıdır. Bunun aksine, burada önerilen yöntem basit, uygun maliyetli ve etkilidir ve transplantasyondan önce bazal tedavi olarak ve diğer teknolojilerle birlikte konjugasyon olarak kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmanın temel adımları saf hiPSC-CMs elde, Y-27632 pretreatment aracılığıyla hiPSC-CMs etkinliğini geliştirmek ve son olarak, bir fare mı modeline hiPSC-CMs kesin bir miktar nakli içerir.
Burada ele önemli konular, ilk olarak, biz glikoz içermeyen arıtma yöntemleri19 optimize ve yeni bir verimli arıtma sistemi kuruldu. Sistem prosedürü, hücre dağılma enzimleri uygulama dahil, jelatin kaplı plaklarda hücreleri redikasyon, nötralizasyon or…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar nazik Fluc-GFP yapı ve mükemmel teknik yardım için Dr Yanwen Liu sağlayan Dr Joseph C. Wu (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışmada, Ulusal Sağlık Enstitüleri RO1 hibe HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (J.Z.) ve HL121206A1 (iniş) ve bir R56 Grant HL142627 (W.Z.), bir Amerikan Kalp Derneği Bilim adamı kalkınma Grant tarafından desteklenmektedir 16.30410018, ve Alabama Üniversitesi Birmingham fakülte kalkınma Grant (W.Z. için).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
Riferimenti
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
