En kolorimetrisk analyse af citrat syntase aktivitet i Drosophila melanogaster
Summary
Vi præsenterer en protokol for en kolorimetrisk analyse af citrat syntase aktivitet til kvantificering af intakt mitokondrie masse i Drosophila væv homogenater.
Abstract
Mitokondrier spiller de mest fremtrædende roller i cellulære metabolisme ved at producere ATP gennem oxidativ fosforylering og regulere en række fysiologiske processer. Mitokondriel dysfunktion er en primær årsag til en række metaboliske og neurodegenerative sygdomme. Intakt mitokondrier er afgørende for deres korrekte funktion. Enzym citrat syntase er lokaliseret i mitokondrie matrix og kan således anvendes som en kvantitativ enzym markør af intakt mitokondriel masse. I betragtning af at mange molekyler og veje, der har vigtige funktioner i mitokondrier er meget bevaret mellem mennesker og Drosophila, og at en række stærke genetiske værktøjer er tilgængelige i Drosophila, Drosophila fungerer som et godt model system til at studere mitokondrie funktion. Her præsenterer vi en protokol for hurtig og enkel måling af citrat syntase aktivitet i vævs homogenatet fra voksne fluer uden at isolere mitokondrier. Denne protokol er også egnet til måling af citrat syntase aktivitet i larver, dyrkede celler og pattedyrs væv.
Introduction
Mitokondrier er bedst kendt som de Power-producerende organeller i de fleste Eukaryote organismer, der producerer energi valutaen, ATP, gennem tricarboxylsyre cyklus (dvs., krebs cyklus) og oxidativ fosforyl. Mitokondrier er også fundet for at spille vigtige roller i en masse andre fysiologiske processer, såsom regulering af apoptose1, ca2 + homøostase2,3,reaktive oxidations arter (ros) generation4, ogendoplasmatiske reticulum (er)-stress respons5. Mitokondriel dysfunktion kan påvirke ethvert organ i kroppen i alle aldre og er en primær årsag til metaboliske, aging-relaterede6, og neurodegenerative sygdomme7. Intakte mitokondrier er mekanisk relateret til mitokondrie funktion. Således korrekt kvantificering af intakt mitokondrie masse er meget vigtigt for evaluering mitokondrie funktion8. Citrat syntase, en sats-begrænsende enzym i første trin af tricarboxylsyre cyklus9, er lokaliseret i mitokondrie matrix inden for eukaryote celler, og dermed kan bruges som en kvantitativ markør for tilstedeværelsen af intakt mitokondrie masse9,10. Citrat syntase-aktivitet kan også anvendes som normaliseringsfaktor for intakte mitokondrielle proteiner11,12.
Frugten flue, Drosophila melanogaster, er et glimrende model system til at studere mitokondrie funktion, så mange molekyler og veje, der spiller centrale roller i mitokondrier er evolutionært bevaret fra Drosophila til mennesker13,14,15. Her præsenterer vi en protokol for en hurtig og enkel metode til måling af citrat syntase aktivitet ved en kolorimetrisk analyse i Drosophila væv-homogenater16 i en 96 brønd plade format. I citrat syntase aktivitetsanalyse, citrat syntase i Drosophila væv homogenatet katalyserer reaktionen af oxaloacetat med acetyl coenzym A (acetyl COA) til dannelse af citrat COA-sh og H+. CoA-SH reagerer efterfølgende med 5,5 ‘-dithiobis-(2-nitrobenzoesyre) (DTNB) for at frembringe et farvet produkt, 2-Nitro-5-thiobenzoat (TNB), som let kan måles spektrofotometrisk ved 412 nm. Citrat syntase aktivitet kan afspejles af hastigheden af farveproduktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metaboliske undersøgelser ved hjælp af Drosophila som model skal tage hensyn til den genetiske baggrund, kost, og lager vedligeholdelse af fluer18. For at undgå virkningerne af forskellige genetiske baggrunde på målingen af citrat syntase aktivitet, bør forskellige stammer af Drosophila tilbageføres til kontrol stamme for 10 generationer. Den genetiske baggrund af alle Drosophila stammer, der anvendes i vores eksperimenter er w1118, så vi brug…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskuddene fra National Natural Science Foundation i Kina (31401013 og 31471010), videnskabs-og teknologi Kommissionen i Shanghai kommune, Shanghai Pujiang program (14PJ1405900), og Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Riferimenti
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetica. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!. Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson’s model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetica. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
