Une description colorimétrique de l'activité de Synthase Citrate dans Drosophila Melanogaster
Summary
Nous présentons un protocole pour un test colorimétrique de l’activité de synthase de citrate pour la quantification de la masse mitochondriale intacte dans les homogénéités de tissu de Drosophila.
Abstract
Les mitochondries jouent les rôles les plus importants dans le métabolisme cellulaire en produisant de l’ATP par phosphorylation oxydative et en régulant une variété de processus physiologiques. Le dysfonctionnement mitochondrial est une cause primaire d’un certain nombre de maladies métaboliques et neurodégénératives. Les mitochondries intactes sont essentielles à leur bon fonctionnement. La synthase de citrate d’enzyme est localisée dans la matrice mitochondriale et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif d’enzyme de la masse mitochondriale intacte. Étant donné que de nombreuses molécules et voies qui ont des fonctions importantes dans les mitochondries sont fortement conservés entre les humains et Drosophila, et qu’un éventail d’outils génétiques puissants sont disponibles dans Drosophila, Drosophila sert de bon système modèle pour l’étude de la fonction mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour la mesure rapide et simple de l’activité de synthase de citrate dans l’homogénéisation de tissu des mouches adultes sans isoler des mitochondries. Ce protocole convient également à la mesure de l’activité de synthase de citrate dans les larves, les cellules cultivées et les tissus mammifères.
Introduction
Les mitochondries sont surtout connues comme les organites producteurs d’énergie dans la plupart des organismes eucaryotes, qui produisent la monnaie de l’énergie, l’ATP, à travers le cycle de l’acide tricarboxylique (c.-à-d. le cycle Debs) et la phosphorylation oxydative. Les mitochondries jouent également un rôle important dans un grand nombre d’autres processus physiologiques, tels que la régulation de l’apoptose1, Ca2 ‘ homéostasie2,3, espèces d’oxydation réactive (ROS) génération4, et réticulum endoplasmique (ER)-réponse au stress5. Le dysfonctionnement mitochondrial peut affecter n’importe quel organe dans le corps à n’importe quel âge et est une cause primaire des maladies métaboliques, liées au vieillissement6,et neurodegenerative7. Les mitochondries intactes sont mécanistes liées à la fonction mitochondriale. Ainsi, la quantification appropriée de la masse mitochondriale intacte est très importante pour évaluer la fonction mitochondriale8. La synthase de citrate, une enzyme de limitation de taux dans la première étape du cycle d’acide tricarboxylique9,est localisée dans la matrice mitochondriale dans les cellules eucaryotes, et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif pour la présence de la masse mitochondriale intacte9,10. L’activité de synthase de citrate peut également être employée comme facteur de normalisation pour les protéines mitochondriales intactes11,12.
La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est un excellent système modèle pour l’étude de la fonction mitochondriale, comme de nombreuses molécules et les voies qui jouent des rôles pivots dans les mitochondries sont évolutivement conservés de Drosophila à l’homme13,14,15. Ici, nous présentons un protocole pour une méthode rapide et simple pour la mesure de l’activité de synthase de citrate par un test colorimétrique dans le tissu de Drosophila homogénéise16 dans un format de plaque de puits 96. Dans l’analyse de l’activité de synthase de citrate, la synthase de citrate dans le tissu de Drosophila homogénéise catalyse la réaction de l’oxaloacetate avec la coenzyme acétyle A (acétyl CoA) pour former le citrate CoA-SH etH. CoA-SH réagit par la suite avec 5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) pour générer un produit coloré, 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB), qui peut être facilement mesuré spectrophotometrically à 412 nm. L’activité de synthase de citrate peut être reflétée par le taux de production de couleur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les études métaboliques utilisant Drosophila comme modèle doivent prendre en considération le fond génétique, l’alimentation, et l’entretien de stock des mouches18. Afin d’éviter les effets de différents milieux génétiques sur la mesure de l’activité de la synthase du citrate, différentes souches de Drosophila doivent être rétrocroisées à la souche témoin pendant 10 générations. Le fond génétique de toutes les souches de Drosophila utilisées dans no…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions de la National Natural Science Foundation of China (31401013 et 31471010), de la Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, du Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) et de la Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
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