参照されていない太平洋カキからの仮想配列cDNAライブラリの生成のための収束戦略
Summary
我々は、参照されていない太平洋カキ標本からのRNAサンプルを使用する方法の戦略を説明し、公に利用可能なゲノムデータと比較して遺伝物質を評価し、事実上配列されたcDNAライブラリーを生成する。
Abstract
新しい細胞株の開発やゲノムシーケンシングプロジェクトの開発など、以前は主要な実験で使用されていた参照種の生物材料へのアクセスは、多くの場合、さらなる研究や第三者に提供することが困難である。サンプルの消費的な性質。現在、アジア、オーストラリア、北米の太平洋沿岸に広く分布しているが、個々の太平洋カキの標本は遺伝的に非常に多様であり、遺伝子ライブラリーの出発材料として直接は適していない。本稿では、地域の水産物市場から得られた参照されていない太平洋カキの標本を用いてcDNAライブラリーを生成する方法を示す。これらのライブラリーを一般に入手可能なカキゲノムと比較し、最も近い関連ライブラリーをミトコンドリア参照遺伝子サイトクロムCオキシダーゼサブユニットI(COX1)およびNADHデヒドロゲナーゼ(ND)を用いて選択した。生成されたcDNAライブラリーの適合性は、UDP-グルクロン酸脱水素酵素(UGD)とUDP-キシロース合成酵素(UXS)をコードする2つの遺伝子のクローニングと発現によっても実証され、UDP-xyloseから生合成を担当する。UDPブドウ糖。
Introduction
生きた参照生物材料の取得は、長い配達時間、起業家の推論、または国固有の関税規制のために困難な場合があります。代替として、必要な生体材料は、表現非的に同一の標本からも採取されてもよい。しかし、これらのサンプルは遺伝子型のレベルで大きく異なる可能性があるため、同じ種のデジタル保存された参照ゲノムとの比較は、新たに供給された材料の非互換性のためにしばしば困難または無駄にレンダリングされます。既存のDNA増幅方法。個々のサンプルの高度に保存された遺伝子のシーケンシングは、cDNAライブラリーの品質評価のための参照遺伝子として頻繁に使用される保存されたミトコンドリア遺伝子など、種1を同定するための広く使用され、強力なツールです2 ,3,4,5,6.本明細書提示法の根本的な根拠は、参照ゲノムの対応する配列と比較して個々の匿名カキサンプルにおけるミトコンドリア遺伝子配列の高い保存性が、他の遺伝子も示し得ることを示している。核DNA7に対するミトコンドリアDNA進化の一般的に速い速度を考えると、発散のレベルが低く、単に公的に使用するだけで、科学的および産業的に関連する幅広い遺伝子の増幅と分離を可能にする参照として使用可能なシーケンス データ。
本明細書記載法の全体的な目標は、カキ遺伝子のクローニングのためのテンプレートDNAとして使用することができる事実上配列されたカキcDNAライブラリーを生成するための最適化されたワークフローを提示することです。仮想シーケンシングでは、デノボゲノムシーケンシングが回避されます。代わりに、既知のデジタル保存された参照シーケンスは、最終的にライブラリを構成する(または既存のライブラリに追加される)cDNAの生産にプライマーを利用または設計するために直接使用されます。目的は、収束cDNAライブラリーを生成することです, 生成されたcDNA配列と参照配列の間の類似性は、低から高い発散にランク付けできることを意味します.サイトクロムCオキシダーゼサブユニット1(COX1)とNADHデヒドロゲナーゼ(ND)を参照遺伝子として使用する主な利点は、これらのミトコンドリア遺伝子の高い保存性のために、地理的に切断されたカキの標本をプロファイリングできることです。これらの確立されたマーカーとのアプローチを証明した後、我々は、糖ヌクレオチド生合成に関与し、産業関連である可能性がある2つの酵素候補にその応用を実証する8,9,10.太平洋カキのバイオテクノロジーの可能性はまだ未開拓です。したがって、実質的に配列されたcDNAライブラリーを調製するためのこの収束方法は、この関連する生物学的材料からcDNAを生成したい非専門家研究者にも適していると考えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたプロトコルは、公的に利用可能なカキDNAゲノムデータベースとCOX1およびND遺伝子を比較することにより、地域のシーフード市場から同様の表現型を持つ参照されていないカキ標本の遺伝的同定を可能にする。この方法の重要性は、仮想cDNAライブラリーの評価に必要なPCR反応が1つだけであるため、その簡略化にあります。2つの保存されたミトコンドリアCOX1およびND遺伝子は、各カ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国自然科学財団(助成番号31471703、A0201300537、31671854、J.V.とL.L.への助成番号31470435、G.Y.への助成番号31470435)、および100外国人材計画(助成番号JSB2014012.V.)によって一部支援されました。
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
Riferimenti
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