Uma estratégia convergente para a geração de uma biblioteca de cDNA virtualmente seqüenciada de ostras pacíficos não referenciadas
Summary
Nós descrevemos uma estratégia para como usar amostras do RNA dos espécimes de ostra pacíficos não referenciados, e avaliamos o material genético em comparação com os dados publicamente disponíveis do genoma para gerar uma biblioteca virtualmente seqüenciada do cDNA.
Abstract
O acesso ao material biológico de espécies de referência, que foram utilizados anteriormente em experimentos-chave, como no desenvolvimento de novas linhas celulares ou projetos de sequenciamento de genoma, são muitas vezes difíceis de prever estudos ou terceiros devido à natureza consumptiva das amostras. Embora agora distribuído extensamente sobre as costas pacíficos de Ásia, de Austrália e de America do Norte, os espécimes pacíficos individuais da ostra são genetically completamente diverso e são conseqüentemente não diretamente apropriados como o material começar para bibliotecas do gene. Neste artigo, demonstramos o uso de espécimes de ostras pacíficos não referenciados obtidos de mercados regionais de frutos do mar para gerar bibliotecas de cDNA. Essas bibliotecas foram comparadas com o genoma de ostra disponível publicamente, e a biblioteca relacionada mais próxima foi selecionada usando os genes de referência mitocondrial citocromo C oxidase subunidade I (COX1) e NADH desidrogenase (ND). A adequação da biblioteca de cDNA gerada também é demonstrada pela clonagem e expressão de dois genes que codificam as enzimas UDP-glucuronic ácido desidrogenase (UGD) e UDP-xylose sintase (UXS), que são responsáveis pela biossíntese de UDP-xylose de UDP-glicose.
Introduction
A aquisição de material biológico referenciado em vida pode ser desafiadora devido a longos prazos de entrega, raciocínio empreendedor ou regulamentação aduaneira específica do país. Como alternativa, o material biológico necessário também pode ser coletado de espécimes fenotipicamente idênticos. No entanto, essas amostras podem variar significativamente ao nível do genótipo e, portanto, as comparações com genomas de referência armazenados digitalmente da mesma espécie são muitas vezes tornadas difíceis ou mesmo fútil devido à incompatibilidade do material recém-originado com métodos de amplificação de ADN existentes. A sequenciação de genes altamente conservados de amostras individuais é uma ferramenta amplamente utilizada e poderosa para identificar espécies1, tais como genes mitocondrial conservados que são freqüentemente usados como genes de referência para a avaliação da qualidade das bibliotecas de cDNA2 ,3,4,5,6. A fundamentação subjacente para o presente método apresentado é que a alta conservação das sequências de genes mitocondriais em amostras de ostras anônimas individuais em comparação com as sequências correspondentes do genoma de referência indica que outros genes também podem mostrar um baixo nível de divergência, dada a taxa geralmente mais rápida de evolução do DNA mitocondrial em relação ao DNA nuclear7, permitindo a amplificação e isolamento de uma ampla gama de genes cientificamente e industrialmente relevantes, simplesmente usando publicamente dados de sequenciamento disponíveis como referência.
O objetivo geral do presente método descrito é apresentar um fluxo de trabalho otimizado para gerar uma biblioteca de cDNA de ostra virtualmente sequenciada que pode ser usada como DNA de modelo para a clonagem de genes de ostra. Em sequenciamento virtual, o sequenciamento do genoma de novo é contornado; em vez disso, uma seqüência de referência conhecida e armazenada digitalmente é usada diretamente para utilizar ou projetar iniciadores para a produção de cDNAs que acabará por incluir uma biblioteca (ou ser adicionado a um pré-existente). O objetivo é produzir uma biblioteca de cDNA convergente, o que significa que as semelhanças entre as sequências de cDNA geradas e a sequência de referência podem ser classificadas de baixa a alta divergência. Uma vantagem chave de usar o subunidade 1 da oxidase do cytochrome C (COX1) e o dehydrogenase de NADH (ND) como genes da referência é que mesmo os espécimes altamente geograficamente disjunção da ostra podem ser perfilados devido à conservação elevada destes genes mitochondrial. Tendo provado a abordagem com esses marcadores bem estabelecidos, demonstramos sua aplicação a dois candidatos enzimáticos que estão envolvidos na biossíntese de nucleotídeo açucareiro e podem ser de relevância industrial8,9, 10. o potencial biotecnológico da ostra do Pacífico ainda é inexplorado. Assim, acreditamos que este método convergente para a preparação de uma biblioteca de cDNA virtualmente sequenciada também será adequado para pesquisadores não especializados que desejam gerar cDNA a partir deste material biológico relevante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado permite a identificação genética de espécimes não referenciados da ostra com phenotype similar dos mercados regionais do marisco pela comparação dos genes de COX1 e de ND com uma base de dados publicamente disponível do genoma do ADN da ostra. O significado desse método reside na sua simplicidade, pois apenas uma única reação de PCR é necessária para a avaliação da biblioteca virtual de cDNA. Os dois conservaram os genes COX1 e ND mitochondrial foram amplificados de uma biblioteca …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação de ciências naturais da China (conceder números 31471703, A0201300537 e 31671854 para J.V. e ll, conceder o número 31470435 para G.Y.), e o plano de talentos estrangeiros 100 (número de subvenção JSB2014012 para J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
Riferimenti
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