1 차적인 뮤린 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양물의 급속한 생성
Summary
이 프로토콜은 0-4일 된 마우스의 피부로부터 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양을 동시에 생성하는 신속한 방법을 간략하게 설명한다. 이러한 1차 배양은 피부 세포 생물학, 색소 침착, 상처 치유 및 흑색종을 포함한 다양한 생리학적 관련 과정을 연구하기 위해 시험관 내에서 유지 및 조작될 수 있다.
Abstract
섬유아세포 또는 멜라닌세포 기능의 결함은 열악한 장벽 기능, 결함있는 상처 치유, 색소 침착 결함 및 암을 포함한 피부 질환과 관련이 있습니다. 이러한 질병의 이해와 개량에 필수적인 것은 1 차적인 섬유아세포 및 멜라닌세포 배양에서의 실험이다. 그럼에도 불구하고, 멜라닌세포 격리를 위한 현재 프로토콜은 피부의 표피 및 진피 층이 트립시니화되고 수동으로 분리되도록 요구한다. 이 프로세스는 시간이 많이 걸리고 기술적으로 어렵고 일관성없는 수율에 기여합니다. 더욱이, 동일한 조직 샘플로부터 순수한 섬유아세포 배양을 동시에 생성하는 방법은 용이하게 사용할 수 없다. 여기서, 우리는 출생 후 일 0-4에 마우스의 피부에서 멜라닌 세포와 섬유 아세포를 분리하기위한 개선 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에서 전체 피부는 조직 헬기를 사용하여 기계적으로 균질화된 다음 콜라게나아제와 트립신으로 간략하게 소화됩니다. 세포 집단은 G418 처리에 선행된 선택적인 도금을 통해 그 때 단리됩니다. 이 절차는 90 분 이내에 단일 마우스에서 일관된 멜라닌 세포 및 섬유 아세포 수율을 초래한다. 이 프로토콜은 또한 쉽게 확장 할 수 있으므로 연구원은 실습 시간의 상당한 증가없이 동물의 큰 집단을 처리 할 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여 확립된 배양이 멜라닌세포 또는 섬유아세포에 대해 매우 풍부하다는 것을 유동 세포 측정 평가를 통해 보여줍니다.
Introduction
포유류 피부는 이물질과 자외선 조사 (UVR)로부터 신체를 보호하는 다층 기관입니다. 피부는 또한 상처 치유, 온도 조절 및 비타민 D 생산 1,2,3과같은 항상성 과정에 중요한 역할을합니다. 포유류 피부는 멜라닌 세포, 섬유아세포 및 각질 세포의 세 가지 주요 세포 유형으로 구성됩니다. 이러한 세포 유형은 표피를 구성하는 각질 세포, 진피및 멜라닌 세포에 거주하는 섬유아세포가 표피-진피 접합부 및 모낭에 국한되는 등피부의 상이한 층을 채웁니다 4. 여기에서, 우리는 뮤린 피부에서 1 차적인 melanocyte 및 섬유아세포 배양물의 동시 생성을 가능하게 하는 간단한 절차를 자세히 설명합니다.
멜라닌세포는 기저표피, 홍채, 달팽이관, 뇌 및 모낭을 포함한 인체 전역의 많은 위치에서 발견되는 안료 생성 세포5. 멜라닌세포의 주요 기능은 멜라닌 함유 소포를 5,6. 멜라노솜은 멜라닌의 두 가지 주요 클래스를 포함: 갈색/블랙 유멜라닌과 노란색/레드 페오멜라닌6,7. 멜라닌세포 내의 생화학적 과정은 각 멜라닌 종의 상대적 풍부를 조절하고 모발, 피부 및 눈 색깔을 결정하는 데 도움을 줍니다8,9. 멜라닌은 또한 UVR을 흡수하고 돌연변이 발생10에서태양 에 노출된 조직을 보호하는 역할을합니다.
Melanocyte 기능 장애는 색소 결함을 일으키는 원인이 되고 피부암 감수성을 증가할 수 있습니다. 예를 들어, 멜라스마의 특징인 과색색 피부 패치는 국소 멜라닌 과잉 생산의 결과인 반면, 멜라닌 합성에 관여하는 유전자를 손상시키는 생식선 유전 적 돌연변이는 백색증11,12로 이어진다. . melanocyte 생물학의 친밀한 지식은 그 같은 색소 결함을 정정하고 궁극적으로 이 질병으로 고통받는 개별의 심리사회적 복지를 향상할 전략을 개발하기 위하여 요구됩니다. 멜라닌 생산 및/또는 페오멜라닌의 우대 합성에 있는 적자는 또한 증가한 피부암 리스크10와연관됩니다. 이 위험은 감소 된 UVR 보호6,13에서발생하는 것으로 추정된다. 따라서, 멜라닌 세포에서 유멜라닌 생산을 강화 하거나 복원 하는 방법은 이러한 인구에 피부 암의 발생률을 줄일 수 있습니다.
중간 엽 섬유 아세포는 피부(14)의진피 층을 포함하여 신체의 모든 장기에 대한 결합 조직 및 구조적 지지를 확립한다. 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌 및 섬유넥틴과 같은 단백질의 배설은 섬유아세포가 조직 무결성에 필수적인 세포외 매트릭스(ECM)를 형성할 수 있게 한다 1,14. 섬유아세포는 또한 상처 치유, 염증, 혈관신생 및 암 형성/진행과 같은 과정에 필수적인 역할을 한다1,15,16.
멜라닌 세포와 유사하게, 섬유아세포 활성화 및 기능의 결함은 종양 발생 및 질병을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 부적절한 섬유아세포 활성화는 일반적으로 섬유증의 형성으로 이어지며, 이는 과잉 ECM 성분을 주변 조직으로 증착한 결과로 생긴다. 섬유아세포는 신체의 구조적 무결성의 대부분을 유지함에 따라, 섬유증은 특발성 폐 섬유증, 전신 경화증, 간 경화증 및 심장 섬유증을 포함하여 수많은 조직 및 장기에 영향을 미치는 질병을 촉진합니다15. 섬유아세포는 또한 암16에있는 중요한 역할을 합니다. 암 관련 섬유아세포 (CAFs)는 많은 종양의 미세 환경에서 가장 풍부한 비 악성 세포입니다. CAFs는 조직 강성, 국소 사이토카인 생산 및 면역 기능(16)을조절함으로써 종양 증식, 진행 및 치료 내성을 촉진하는 것으로 나타났다.
1 차적인 세포 배양은 질병으로 이끌어 내는 melanocyte 및 섬유아세포 결점을 확인하고 완화하기 위하여 유전으로 견인할 수 있는 모형을 연구원을 제공합니다. 그러나, melanocyte 문화를 설치하는 현재 방법은 시간이 많이 걸리고 기술적으로 도전적입니다. 표피와 진피의 트립시네이드화와 섬세한 분리의 필요성은 실험 수율의 가변성에 기여하고 대규모 실험을 수행하기 어렵게 만듭니다. 더욱이, 전체 피부에서 멜라닌 세포와 섬유아세포를 동시에 분리하는 프로토콜은 현재 현장에서 부족합니다.
우리는 동일한 전체 피부 샘플에서 멜라닌 세포 및 섬유 아세포 배양을 확립하는 데 필요한 처리 단계, 가변성 및 시간을 줄이는 방법을 개발했습니다. 기계적 균질화 방법을 사용하여 간략한 소화를 통해 당사의 전략은 동시 섬유아세포 분리를 가능하게 하면서 1차 멜라닌 을 분리하는 데 필요한 실습 시간을 크게 줄입니다. 이 프로토콜의 증가된 속도, 효율성 및 일관성은 0-4일 된 쥐로부터 멜라닌을 분리하는 능력과 결합하여 연구원들에게 이전에 가능했던 것보다 더 광범위한 실험을 수행할 수 있는 유연성을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
1 차적인 melanocytes및 섬유아세포의 체외 문화는 피부 생물학 및 질병의 우리의 이해에 있는 중요한 전진으로 이끌어 냈습니다. 이 프로토콜은 피부 섬유아세포의 동시 분리를 허용하면서 일관된 멜라닌세포 배양을 생성하는 데 필요한 시간과 기술적 숙련도를 감소시킴으로써 이전의 멜라닌세포 분리 방법을 향상시킵니다. 이 절차의 새로운 시간 절약 요소는 진피와 표피를 분리 할 필요가 없다는…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 데이먼 러니온 재단 (혁신 상 #38-16 에 C.E.B.) 및 펠로토니아 (B.M.M.) 재정 지원을 감사드립니다. 원고 텍스트를 개선하기 위해 의견을 제공한 C. 헤인즈와 C. 웜스배처에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH P30 CA016058에 의해 지원되는 오하이오 주 포괄적인 암 센터의 분석 세포 분석 공유 자원에서 유익했습니다.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
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