प्राथमिक मूत्र मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की तीव्र पीढ़ी
Summary
इस प्रोटोकॉल एक साथ 0-4 दिन पुराने चूहों की त्वचा से मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए एक तेजी से विधि की रूपरेखा. इन प्राथमिक संस्कृतियों को बनाए रखा जा सकता है और त्वचा कोशिका जीव विज्ञान, pigmentation, घाव भरने और मेलेनोमा सहित शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाओं की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए इन प्राथमिक संस्कृतियों में हेरफेर किया जा सकता है।
Abstract
फाइब्रोब्लास्ट या मेलेनोसाइट समारोह में दोष त्वचा रोगों के साथ जुड़े रहे हैं, गरीब बाधा समारोह सहित, दोषपूर्ण घाव भरने, pigmentation दोष और कैंसर. इन रोगों की समझ और सुधार के लिए महत्वपूर्ण प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट और मेलेनोसाइट संस्कृतियों में प्रयोग कर रहे हैं। फिर भी, मेलेनोसाइट अलगाव के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल की आवश्यकता है कि त्वचा के एपिडर्मल और dermal परतों trypsinized और मैन्युअल रूप से असंबद्ध हैं. इस प्रक्रिया में समय लगता है, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और असंगत पैदावार के लिए योगदान देता है. इसके अलावा, एक साथ एक ही ऊतक नमूना से शुद्ध फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए तरीकों आसानी से उपलब्ध नहीं हैं. यहाँ, हम प्रसव के बाद के दिनों में चूहों की त्वचा से मेलेनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स को अलग करने के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन 0-4. इस प्रोटोकॉल में, पूरी त्वचा यंत्रवत् एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग कर homogenized है और फिर संक्षेप में collagenase और trypsin के साथ पचा. सेल आबादी तो चयनात्मक चढ़ाना G418 उपचार के बाद के माध्यम से अलग कर रहे हैं. इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप संगत मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट की पैदावार एक ही माउस से 90 मिनट से कम समय में होती है। इस प्रोटोकॉल भी आसानी से स्केलेबल है, शोधकर्ताओं के हाथ पर समय में एक महत्वपूर्ण वृद्धि के बिना जानवरों के बड़े साथियों को संसाधित करने के लिए अनुमति देता है. हम प्रवाह साइटोमेट्रिक आकलन के माध्यम से दिखाते हैं कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्थापित संस्कृतियां मेलेनोसाइट्स या फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए अत्यधिक समृद्ध हैं।
Introduction
मैमलियन त्वचा एक बहुस्तरीय अंग है जो शरीर को विदेशी रोगजनकों और अल्ट्रा वायलेट विकिरण (यूवीआर) से बचाता है। त्वचा भी घाव भरने , तापमान विनियमन और विटामिन डी उत्पादन1,2,3 के रूप में homeostatic प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाताहै. मैमलेशियन त्वचा में तीन प्रमुख कोशिका प्रकार होते हैं: मेलेनोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट और केराटिनोसाइट्स। इन कोशिका प्रकारों त्वचा की विभिन्न परतों को आबाद, केराटिनसाइट्स के साथ बाह्य त्वचा बनाने, फाइब्रोब्लास्ट्स dermis और मेलेनोसाइट्स में रहने वाले epidermal-dermal जंक्शन और बाल follicles4के लिए स्थानीयकृत. यहाँ, हम एक सरल प्रक्रिया है कि murine त्वचा से प्राथमिक मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की समवर्ती पीढ़ी सक्षम बनाता है विस्तार.
मेलेनोसाइट्स वर्णक-उत्पादक कोशिकाएं हैं जो मानव शरीर में कई स्थानों पर पाई जाती हैं, जिनमें बेसल एपिडरमिस, आईरिस, कोचला, मस्तिष्क और बाल कूप5शामिल हैं। मेलेनोसाइट्स का प्राथमिक कार्य मेलेनिन युक्त vesicles को उत्पन्न और स्रावित करना है जिसे मेलेनोसोम5,6कहा जाता है . मेलेनोसोम मेलेनिन के दो प्रमुख वर्गों होते हैं: भूरे / मेलेनोसाइट के भीतर जैव रासायनिक प्रक्रियाएं प्रत्येक मेलेनिन प्रजातियों की सापेक्ष बहुतायत को नियंत्रित करती हैं और बाल, त्वचा और आंखों का रंग8,9 निर्धारित करने में मदद करतीहैं. Melanin भी UVR को अवशोषित और mutagenesis10से सूर्य उजागर ऊतकों की रक्षा के लिए कार्य करता है.
मेलेनोसाइट रोग वर्णक दोष पैदा कर सकता है और त्वचा कैंसर की संवेदनशीलता को बढ़ा सकता है। उदाहरण के लिए, अति-पिगमेंटेड त्वचा पैच मेल्स्मा की विशेषता फोकल मेलेनिन overproduction का परिणाम है, जबकि germline आनुवंशिक उत्परिवर्तन जो मेलेनिन संश्लेषण में शामिल जीन समझौता albinism के लिए नेतृत्व11,12 . मेलेनोसाइट जीव विज्ञान के अंतरंग ज्ञान के लिए रणनीति है कि इस तरह के pigmentary दोषों को सही और अंततः इन रोगों से पीड़ित व्यक्तियों की मनोसामाजिक भलाई में सुधार होगा विकसित करने के लिए आवश्यक है. मेलेनिन उत्पादन में कमी और / या फीओमेलानिन के अधिमानी संश्लेषण भी त्वचा कैंसर के जोखिम10के साथ जुड़े रहे हैं . ऐसा माना जाता है कि यह जोखिम कम यूवीआर संरक्षण6,13से होता है . इस प्रकार, मेलेनोसाइट्स में यूमेलेनिन उत्पादन को बढ़ाने या बहाल करने के तरीके इन आबादी में त्वचा कैंसर की घटनाओं को कम कर सकते हैं।
मेसेन्काइमल फाइब्रोब्लास्ट्स त्वचा 14 की त्वचा परत सहित शरीर के सभीअंगों के लिए संयोजी ऊतक और संरचनात्मक समर्थन की स्थापना करते हैं। कोलेजन, इलेस्टिन, लेमिनिन और फाइब्रोनेक्टिन जैसे प्रोटीनों का उत्सर्जन फाइब्रोब्लास्टकोन को ऊतक अखंडता 1,14के लिए आवश्यक अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) बनाने में सक्षम करता है। फाइब्रोब्लास्ट्स भी घाव भरने, सूजन, एंजियोजेनेसिस और कैंसर गठन / प्रगति1,15,16के रूप में प्रक्रियाओं में आवश्यक भूमिका निभाते हैं।
मेलेनोसाइट्स के समान, फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण और समारोह में दोष ट्यूमरजनन और रोग को बढ़ावा दे सकते हैं। उदाहरण के लिए, अनुचित फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण आमतौर पर फाइब्रोसिस के गठन की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप आसपास के ऊतकों में अतिरिक्त ईसीएम घटकों के बढ़ाया जमाव होता है। फाइब्रोब्लास्ट्स शरीर की संरचनात्मक अखंडता के बहुत बनाए रखने के रूप में, फाइब्रोसिस रोगों है कि कई ऊतकों और अंगों को प्रभावित को बढ़ावा देता है, अज्ञातहेतुक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस, प्रणालीगत स्क्लेरोसिस, लीवर सिरोसिस और हृदय फाइब्रोसिस15सहित. फाइब्रोब्लास्ट्स भी कैंसर16में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) कई ट्यूमर के microenvironment में सबसे प्रचुर मात्रा में गैर घातक कोशिकाओं रहे हैं। CAFs ऊतक कठोरता, स्थानीय cytokine उत्पादन और प्रतिरक्षा समारोह16नियमन द्वारा ट्यूमर प्रसार, प्रगति और चिकित्सीय प्रतिरोध को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है.
प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों की पहचान करने और रोग के लिए नेतृत्व करने वाले मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट दोषों को कम करने के लिए आनुवंशिक रूप से पथ्य मॉडल के साथ शोधकर्ताओं को प्रदान करते हैं। हालांकि, melanocyte संस्कृतियों की स्थापना के लिए वर्तमान तरीकों समय लगता है और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं. बाह्य त्वचा और dermis के trypsinization और नाजुक जुदाई के लिए की जरूरत प्रयोगात्मक उपज में परिवर्तनशीलता के लिए योगदान देता है और यह मुश्किल बड़े पैमाने पर प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए बनाता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल एक साथ पूरी त्वचा से मेलेनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्टकोश को अलग करने के लिए वर्तमान में क्षेत्र में कमी कर रहे हैं।
हम प्रसंस्करण कदम, परिवर्तनशीलता और एक ही पूरे त्वचा के नमूने से मेलेनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की स्थापना के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए एक विधि विकसित की है। एक संक्षिप्त पाचन के बाद एक यांत्रिक homogenization विधि का उपयोग करना, हमारी रणनीति काफी समवर्ती फाइब्रोब्लास्ट अलगाव को सक्षम करते हुए प्राथमिक मेलेनोसाइट्स को अलग करने के लिए आवश्यक हाथों पर समय की मात्रा कम हो जाती है। वृद्धि की गति, दक्षता और इस प्रोटोकॉल की स्थिरता, 0-4 दिन पुराने चूहों से मेलेनोसाइट्स को अलग करने की क्षमता के साथ संयोजन में, शोधकर्ताओं को पहले से संभव प्रयोगों की एक व्यापक सरणी प्रदर्शन करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्राथमिक मेलेनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स की इन विट्रो संस्कृति ने त्वचा जीव विज्ञान और रोग की हमारी समझ में महत्वपूर्ण प्रगति की है। इस प्रोटोकॉल त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स के एक साथ अलगाव के लिए अनु?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकवित्तीय सहायता के लिए दामन रनियन फाउंडेशन (#38-16 से C.E.B.) और पेलोटोनिया (बी.एम.एम.) का धन्यवाद करते हैं। हम सी Haines और सी Wormsbaecher जो पांडुलिपि पाठ में सुधार करने के लिए टिप्पणी प्रदान करने के लिए आभारी हैं. यह काम ओहियो राज्य व्यापक कैंसर केंद्र विश्लेषणात्मक Cytometry साझा संसाधन जो NIH P30 CA016058 द्वारा समर्थित है से लाभान्वित.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
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