原発性マウスメラノサイトと線維芽細胞培養の急速な生成
Summary
このプロトコルは、0〜4日前マウスの皮膚からメラノサイトおよび線維芽細胞培養物を同時に生成する迅速な方法を概説する。これらの一次培養は、皮膚細胞生物学、色素沈着、創傷治癒および黒色腫を含む様々な生理学的に関連するプロセスを研究するために、インビトロで維持および操作することができる。
Abstract
線維芽細胞またはメラノサイト機能の欠陥は、バリア機能の低下、創傷治癒の欠陥、色素沈着欠陥および癌を含む皮膚疾患に関連している。これらの疾患の理解と改善に不可欠なのは、一次線維芽細胞およびメラノサイト培養における実験である。それにもかかわらず、メラノサイト単離のための現在のプロトコルは、皮膚の表皮層および真皮層がトリプシン化され、手動で関連付け解除される必要があります。このプロセスは時間がかかり、技術的に困難であり、一貫性のない収率に寄与します。さらに、同じ組織試料から純粋な線維芽細胞培養物を同時に生成する方法は容易に入手できない。ここでは、出生後0-4日目にマウスの皮膚からメラノサイトおよび線維芽細胞を分離するための改善されたプロトコルについて説明する。このプロトコルでは、皮膚全体が組織チョッパーを使用して機械的に均質化され、その後、コラゲナーゼとトリプシンで簡単に消化される。細胞集団は、その後、G418処理に続いて選択的めっきを通して単離される。この手順は、90分未満で単一のマウスから一貫したメラノサイトと線維芽細胞の収量をもたらす。このプロトコルはスケーラブルでもあり、研究者は実践的な時間を大幅に増やすことなく、動物の大きなコホートを処理することができます。我々は、このプロトコルを使用して確立された培養物がメラノサイトまたは線維芽細胞に対して非常に濃縮されていることをフローサイトメトリック評価を通して示す。
Introduction
哺乳類の皮膚は、外来病原体や紫外線照射(UVR)から体を保護する多層器官です。皮膚はまた、創傷治癒、温度調節およびビタミンD産生1、2、3などの恒待プロセスにおいて重要な役割を果たしている。哺乳類の皮膚は、メラノサイト、線維芽細胞およびケラチノサイトの3つの主要な細胞タイプからなる。これらの細胞型は皮膚の異なる層に入り込み、表皮を構成するケラチノサイト、真皮およびメラノサイトに存在する線維芽細胞が表皮真皮接合部および毛包4に局在する。ここでは、マウスの皮膚から一次メラノサイトと線維芽細胞培養物の同時生成を可能にする簡単な手順を詳しく説明します。
メラノサイトは、基礎表皮、虹彩、簡膜、脳および毛包5を含む人体全体の多くの場所で見つかった色素産生細胞である。メラノサイトの主な機能は、メラノソーム5、6と呼ばれるメラニン含有小胞を生成し、分泌することです。メラノソームは、メラニンの2つの主要なクラスが含まれています: 茶色/黒ユーメラニンと黄色/赤フェオメラニン6,7.メラノサイト内の生化学的プロセスは、各メラニン種の相対的な存在量を調節し、髪、皮膚および目の色8、9を決定するのに役立ちます。メラニンはまた、UVRを吸収し、変異発生から太陽にさらされた組織を保護するのに役立ちます10.
メラノサイト機能不全は、色素欠損を引き起こし、皮膚癌の感受性を高めることができます。例えば、メラスマの超色素性皮膚パッチは、焦点メラニン過剰産生の結果であるのに対し、メラニン合成に関与する遺伝子を損なう生殖細胞系遺伝子変異はアルビニズム11、12につながる.メラノサイト生物学の深い知識は、このような色素不全を修正し、最終的にこれらの疾患に苦しむ個人の心理社会的幸福を改善する戦略を開発するために必要とされます。メラニン産生および/またはフェオメラニンの優遇合成の欠損はまた、増加した皮膚癌リスク10に関連している。このリスクは、UVR保護6、13の減少に起因すると考えられている。したがって、メラノサイトにおけるユーメラニン産生を増強または回復させる方法は、これらの集団における皮膚癌の発生率を減少させることができる。
間葉線維芽細胞は、皮膚14の真皮層を含む身体のすべての器官の結合組織および構造支持体を確立する。コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチンなどのタンパク質の排泄により、線維芽細胞が組織の完全性1、14に不可欠な細胞外マトリックス(ECM)を形成することができます。線維芽細胞はまた、創傷治癒、炎症、血管新生および癌形成/進行1、15、16などのプロセスにおいて重要な役割を果たす。
メラノサイトと同様に、線維芽細胞活性化および機能の欠陥は、腫瘍形成および疾患を促進することができる。例えば、不適切な線維芽細胞活性化は、一般的に線維化の形成につながり、周囲の組織への過剰なECM成分の増強堆積に起因する。線維芽細胞は身体の構造的完全性の多くを維持するにつれて、線維症は特発性肺線維症、全身性硬化症、肝硬変および心臓線維症を含む多数の組織および器官に影響を与える疾患を促進する15。線維芽細胞はまた、癌16で重要な役割を果たしています.癌関連線維芽細胞(CAF)は、多くの腫瘍の微小環境において最も豊富な非悪性細胞である。CAFは、組織の剛性、局所的なサイトカイン産生および免疫機能16を調節することにより腫瘍増殖、進行および治療抵抗を促進することが示されている。
一次細胞培養は、疾患につながるメラノサイトおよび線維芽細胞欠損を同定し、軽減するための遺伝的に扱いやすいモデルを研究者に提供します。しかし、メラノサイト培養を確立する現在の方法は、時間がかかり、技術的に困難です。表皮と真皮のトリプシン化と繊細な分離の必要性は、実験収率の変動に寄与し、大規模な実験を行うことを困難にする。さらに、皮膚全体からメラノサイトと線維芽細胞を同時に分離するプロトコルは、現在、この分野に欠けている。
我々は、同じ皮膚サンプルからメラノサイトおよび線維芽細胞培養物を確立するために必要な処理ステップ、変動性および時間を低減する方法を開発した。機械的均質化法と短い消化を使用して、我々の戦略は、同時線維芽細胞分離を可能にしながら、一次メラノサイトを分離するために必要な実践的な時間の量を大幅に減少させる。このプロトコルの速度、効率および一貫性の増加は、0〜4日前のマウスからメラノサイトを単離する能力と組み合わせることで、研究者に以前よりも広い配列の実験を行う柔軟性を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
一次メラノサイトと線維芽細胞のインインビトロ培養は、皮膚生物学と疾患に関する我々の理解において大きな進歩をもたらした。このプロトコルは、皮膚線維芽細胞の同時単離を可能にしながら、一貫したメラノサイト培養物を生成するために必要な時間と技術的な精通を減らすことによって、以前のメラノサイト単離方法を改善します。この手順の新しい、時間を節約する要素は、真皮?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、デーモン・ルニヨン財団(イノベーション賞#38-16~C.E.B.)とペロトニア(B.M.M.)の財政支援に感謝しています。原稿文を改善するためのコメントを提供してくれたC・ヘインズとC.ワームスバエッチャーに感謝しています。この研究は、NIH P30 CA016058によってサポートされているオハイオ州総合癌センターの分析サイトメトリー共有リソースの恩恵を受けました。
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
Riferimenti
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