Rapid Generation av primær murine melanocyte og Fibroblast kulturer
Summary
Denne protokollen skisserer en rask metode for å samtidig generere melanocyte og Fibroblast kulturer fra huden på 0-4 dag gamle mus. Disse primære kulturene kan opprettholdes og manipuleres in vitro for å studere en rekke fysiologisk relevante prosesser, inkludert hud cellebiologi, pigmentering, sår helbredelse og melanom.
Abstract
Defekter i Fibroblast eller melanocyte funksjon er forbundet med hudsykdommer, inkludert dårlig barrierefunksjon, defekt sår helbredelse, pigmentering defekter og kreft. Avgjørende for forståelsen og forbedring av disse sykdommene er eksperimenter i primære Fibroblast og melanocyte kulturer. Likevel, gjeldende protokoller for melanocyte isolasjon krever at epidermal og dermal lag av huden er trypsinized og manuelt disassociated. Denne prosessen er tidkrevende, teknisk utfordrende og bidrar til inkonsekvent avkastning. Videre metoder for å samtidig generere rene Fibroblast kulturer fra samme Vevsprøve er ikke lett tilgjengelig. Her beskriver vi en forbedret protokoll for å isolere melanocytter og fibroblaster fra huden til mus på postnatal dager 0-4. I denne protokollen er hele huden mekanisk homogenisert ved hjelp av et vev helikopter og deretter kort fordøyd med kollagenase og Trypsin. Celle populasjoner blir deretter isolert gjennom selektiv plating etterfulgt av G418 behandling. Denne prosedyren resulterer i konsekvent melanocyte og Fibroblast gir fra en enkelt mus på mindre enn 90 min. Denne protokollen er også lett skalerbar, slik at forskerne kan behandle store kohorter av dyr uten en betydelig økning i hands-on tid. Vi viser gjennom Flow analytiske vurderinger som kulturer etablert ved hjelp av denne protokollen er svært beriket for melanocytter eller fibroblaster.
Introduction
Pattedyr hud er en flerlags organ som beskytter kroppen fra utenlandske patogener og Ultra Violet bestråling (UVR). Huden spiller også en avgjørende rolle i homøostatisk prosesser som sår helbredelse, temperaturregulering og vitamin D produksjon1,2,3. Pattedyr hud består av tre store celletyper: melanocytter, fibroblaster og keratinocytter. Disse celletyper fylle forskjellige lag av huden, med keratinocytter gjør opp epidermis, fibroblaster bosatt i dermis og melanocytter lokalisere til epidermal-dermal veikryss og hårsekker4. Her detalj vi en enkel prosedyre som gjør det mulig for samtidig generering av primære melanocyte og Fibroblast kulturer fra murine hud.
Melanocytter er pigment-produserende celler som finnes i mange steder i hele kroppen, inkludert basal epidermis, Iris, cochlea, hjerne og hårsekker5. Den primære funksjon av melanocytter er å generere og skiller melanin inneholder blemmer kalt melanosomer5,6. Melanosomer inneholder to store klasser av melanin: brun/svart eumelanin og gul/rød pheomelanin6,7. Biokjemiske prosesser innenfor melanocyte regulere den relative overflod av hver melanin arter og bidra til å bestemme hår, hud og øyenfarge8,9. Melanin tjener også til å absorbere UVR og beskytte sol-eksponert vev fra mutagenese10.
Melanocyte dysfunksjon kan forårsake pigmentær defekter og øke hudkreft mottakelighet. For eksempel, den hyper-pigmentert hud patcher karakteristisk for melasma er resultatet av fokal melanin overproduksjon, mens germline genetiske mutasjoner som kompromiss gener involvert i melanin syntese føre til albinisme11,12 . Intim kjennskap til melanocyte biologi er nødvendig for å utvikle strategier som vil rette opp slike pigmentær defekter og til slutt forbedre den psykososiale trivsel for individer plaget med disse sykdommene. Underskudd i melanin produksjon og/eller fortrinnsrett syntese av pheomelanin er også forbundet med økt hudkreft risiko10. Denne risikoen antas å skyldes redusert UVR Protection6,13. Således, metoder å forsterke eller restaurere eumelanin produksjon inne melanocytter kanskje nedskrive forekomsten av hud kreften inne disse befolkninger.
Mesenchymal fibroblaster etablere bindevev og strukturell støtte for alle organer i kroppen, inkludert dermal laget av huden14. Utskillelse av proteiner som kollagen, elastin, laminin og fibronektin muliggjør fibroblaster for å danne ekstracellulære Matrix (ECM) som er essensielt for vev integritet1,14. Fibroblaster spiller også viktige roller i prosesser som sår helbredelse, inflammasjon, angiogenese og kreft dannelse/progresjon1,15,16.
Analog med melanocytter, feilene inne Fibroblast aktivisering og funksjonen kanne fremme tumorigenesis og sykdommen. For eksempel, upassende Fibroblast aktivering vanligvis fører til dannelsen av fibrose, som følge av den forbedrede deponering av overflødige ECM komponenter i det omkringliggende vevet. Som fibroblaster opprettholde mye av kroppens strukturelle integritet, fibrose fremmer sykdommer som påvirker mange vev og organer, inkludert idiopatisk lunge fibrose, systemisk sklerose, skrumplever og hjerte fibrose15. Fibroblaster spiller også en avgjørende rolle i kreft16. Kreft assosiert fibroblaster (CAFs) er den mest tallrike ikke-ondartet celler i mikromiljøet av mange svulster. CAFs har vist å fremme tumor spredning, progresjon og terapeutisk motstand ved modulerende vev stivhet, lokal cytokin produksjon og immun funksjon16.
Primær cellekulturer gi forskere med genetisk medgjørlig modeller for å identifisere og dempe melanocyte og Fibroblast defekter som fører til sykdom. Men dagens metoder for å etablere melanocyte kulturer er tidkrevende og teknisk utfordrende. Behovet for trypsinization og delikat separasjon av epidermis og dermis bidrar til variasjon i eksperimentell avkastning og gjør det vanskelig å utføre store eksperimenter. Videre, protokoller å samtidig isolere melanocytter og fibroblaster fra hele hud er aktuelle mangler inne feltet.
Vi har utviklet en metode for å redusere behandlingstrinnene, variasjonen og tiden som kreves for å etablere melanocyte og Fibroblast kulturer fra samme hele hud prøve. Ved hjelp av en mekanisk homogenisering metode etterfulgt av en kort fordøyelse, vår strategi betydelig reduserer mengden av hands-on tid som kreves for å isolere primære melanocytter mens muliggjør samtidige Fibroblast isolasjon. Den økte hastigheten, effektiviteten og konsistensen i denne protokollen, i kombinasjon med evnen til å isolere melanocytter fra 0-4 dag gamle mus, gir forskerne fleksibilitet til å utføre et bredere spekter av eksperimenter enn det som tidligere var mulig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den in vitro kulturen i primær melanocytter og fibroblaster har ført til betydelige fremskritt i vår forståelse av hud biologi og sykdom. Denne protokollen forbedrer på tidligere melanocyte isolasjon metoder ved å redusere tiden og tekniske savvy nødvendig for å generere konsistente melanocyte kulturer samtidig som for samtidig isolering av huden fibroblaster. En roman, tidsbesparende element i denne prosedyren er at dermis og epidermis ikke trenger å skilles. I stedet, hudceller er isolert ved hjelp av konsekve…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-16 til C.E.B.) og Pelotonia (B.M.M.) for økonomisk støtte. Vi er takknemlige for C. Haines og C. Wormsbaecher som ga kommentarer for å forbedre manuskriptet tekst. Dette arbeidet dratt nytte av Ohio State Comprehensive Cancer Center ‘ s Analytical flowcytometri delt ressurs som er støttet av NIH P30 CA016058.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
Riferimenti
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A. Skin temperature: its role in thermoregulation. Acta Physiologica (Oxf). 210 (3), 498-507 (2014).
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35 (2), 193-199 (2009).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Melanocytes and their diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (5), (2014).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K. Oculocutaneous albinism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 2, 43 (2007).
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D’Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T. UV radiation and the skin. International Journal of Molecular Science. 14 (6), 12222-12248 (2013).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
