Primer Murine melanosit ve fibroblast kültürlerinin hızlı üretimi
Summary
Bu protokol, 0-4 gün eski farelerin derisinden melanosit ve fibroblast kültürlerini eşzamanlı olarak oluşturmak için hızlı bir yöntem özetliyor. Bu primer kültürler, cilt hücresi biyolojisi, pigmentasyon, yara iyileşmesi ve melanom dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili süreçlerin çeşitli çalışma için muhafaza ve manipüle edilebilir.
Abstract
Fibroblast veya melanosit fonksiyonunda hatalar, zayıf bariyer fonksiyonu, arızalı yara iyileşmesi, pigmentasyon kusurları ve kanser gibi cilt hastalıkları ile ilişkilidir. Bu hastalıkların anlaşılması ve iyileştirilmesi için hayati önem taşıyan primer fibroblast ve melanosit kültürlerinde deneyler vardır. Bununla birlikte, melanosit izolasyonu için geçerli protokoller cildin Epidermal ve dermal katmanlarının tripsinize ve el ile ilişkilendirilmemiş olmasını gerektirir. Bu işlem zaman alıcı, teknik olarak zorlu ve tutarsız verimler katkıda bulunur. Ayrıca, aynı zamanda aynı doku örneğinden saf fibroblast kültürlerini aynı anda oluşturmak için yöntemler kolayca kullanılabilir değildir. Burada, postnatal günlerde 0-4 farelerin derisinden melanosit ve fibroblastlar izole etmek için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokolde, tüm cilt mekanik bir doku helikopteri kullanılarak homojenize ve sonra kısaca kolajenaz ve tripsin ile sindirilir. Hücre nüfusu daha sonra seçici kaplama ile G418 tedavi takip izole edilir. Bu prosedür, tek bir fareyle 90 dakikadan az bir sürede tutarlı melanosit ve fibroblast verimleri ile sonuçlanır. Bu protokol de kolayca ölçeklenebilir, araştırmacılar el-zamanında önemli bir artış olmadan hayvanların büyük Kohortlar işlemek için izin. Bu protokol kullanılarak kurulan kültürlerin melanosit veya fibroblastlar için son derece zenginleşmesini sağlayan akış cytometrik değerlendirmelerini gösteriyoruz.
Introduction
Mammalin derisi, vücudu yabancı patojenlere ve ultra menekşe ışınlarına (UVR) karşı koruyan çok katmanlı bir organıdır. Deri aynı zamanda yara iyileşmesi, sıcaklık düzenlemesi ve D vitamini üretimi1,2,3gibi homeostatik süreçlerde de kritik bir rol oynar. Memeli cilt üç büyük hücre türlerinden oluşur: melanosit, fibroblastlar ve keratinositler. Bu hücre türleri cildin farklı katmanlarını doldurur, epidermis yapan keratinositler, dermis ve melananosit epidermal-dermal kavşak ve saç folikülleri lokalize yaşayan fibroblastlar4. Burada, duvar derisinden primer melanosit ve fibroblast kültürlerinin eşzamanlı üretimi sağlayan basit bir prosedür ayrıntılarıyla.
Melanosit, bazal epidermis, İris, koklea, beyin ve saç folikülleri5de dahil olmak üzere insan vücudu boyunca birçok yerde bulunan pigment üreten hücrelerdir. Melanositlerin primer işlevi, melanom5,6olarak adlandırılan melanin içeren veziküller oluşturmak ve salgılayacaktır. Melanosomes melanin iki ana sınıfları içerir: kahverengi/siyah eumelanin ve sarı/kırmızı pheomelanin5/6. Melanosit içinde biyokimyasal süreçler her melananin türünün göreceli bolluk düzenleyen ve saç belirlemek için yardım, cilt ve göz rengi8,9. Melanin de UVR absorbe ve mutagenez10güneş maruz dokular korumak için hizmet vermektedir.
Melanosit disfonksiyon pigmente kusurları neden olabilir ve cilt kanseri duyarlılığını artırabilir. Örneğin, hiper-pigmentli cilt melazma karakteristik yamalar fokal melanin aşırı üretim sonucudur, ancak germline genetik mutasyonlar, melanin sentezi, albinizm neden katılan genler taviz11,12 . Melanosit biyolojisinin samimi bilgisi, bu tür pigmente kusurları düzeltecek ve sonuçta bu hastalıklarla oluşan bireylerin psikososyal refah kalitesini artıran stratejiler geliştirmek için gereklidir. Melanin üretimindeki açıkları ve/veya feomelanin Tercihli sentezini de artan cilt kanseri riski ile ilişkilidir10. Bu risk düşük UVR koruma6,13sonucu olduğuna inanılmaktadır. Böylece, melanositlerde eumelanin üretimini geliştirmek veya geri yüklemek için yöntemler bu nüfusun cilt kanseri insidansı azaltabilir.
Mezenkimal fibroblastlar cilt14dermal tabakası dahil olmak üzere vücudun tüm organları için bağ dokusu ve yapısal destek kurmak. Kollajen, elastin, laminin ve fibronektin gibi proteinlerin atılımı, fibroblastların doku bütünlüğü için gerekli olan (ECM) ekstrellüler matrisini oluşturmaya olanak tanır1,14. Fibroblastlar da yara iyileşmesi, inflamasyon, anjiyojenez ve kanser oluşumu/ilerlemesi1,15,16gibi süreçlerde temel roller oynar.
Melanositlere benzer şekilde, fibroblast aktivasyonu ve fonksiyonunda kusurlar tümörijenezde ve hastalığı teşvik edebilir. Örneğin, uygunsuz fibroblast aktivasyonu genellikle fibrozis oluşumuna yol açar ve bu da aşırı ECM bileşenlerinin çevreleyen dokuya gelişmiş birikmesinden kaynaklanan. Fibroblastlar vücudun yapısal bütünlüğünü çok koruyup, fibrozis idiyopatik pulmoner fibrozis, sistemik skleroz, karaciğer sirozu ve kardiyak fibrozis de dahil olmak üzere çok sayıda doku ve organı etkileyen hastalıkları teşvik etmektedir15. Fibroblastlar da kanserde kritik rol oynamaktadır16. Kanser ilişkili fibroblastlar (CAFs) birçok tümörlerin mikroortamında en bol olmayan malign hücreler. Cafs doku sertliği, yerel sitokin üretimi ve bağışıklık fonksiyonu16modüle tarafından tümör proliferasyonu, progresyon ve terapötik direnç teşvik gösterilmiştir.
Primer Hücre kültürleri, hastalıklara yol açacak melanosit ve fibroblast kusurları tanımlamak ve azaltmak için genetiği izlenmeli modeller ile araştırmacılar sağlar. Ancak, melanosit kültürlerini kurmak için geçerli yöntemler zaman alıcı ve teknik olarak zordur. Tripsinizasyon ve epidermis ve dermis hassas ayrılması için ihtiyaç deneysel verim değişkenliğine katkıda bulunur ve zor büyük ölçekli deneyler gerçekleştirmek için yapar. Ayrıca, protokollerin aynı anda tüm cildin melanosit ve fibroblastları izole etmek için şu anda alanda eksik.
Aynı tüm cilt örneğinden melanosit ve fibroblast kültürlerini kurmak için gereken işlem adımlarını, değişkenliği ve zamanı azaltmak için bir yöntem geliştirdik. Kısa bir sindirimi takiben mekanik homojenizasyon yöntemi kullanılarak, stratejimiz, eşzamanlı fibroblast yalıtımı sağlayarak primer melanositlerin yalıtılması için gerekli olan el süresini önemli ölçüde azaltır. Artan hız, verimlilik ve bu protokol tutarlılık, 0-4 gün eski fareler melanosit yalıtma yeteneği ile birlikte, araştırmacılar daha önce mümkün olandan daha geniş bir dizi denemeler yapmak için esneklik sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primer melanosit ve fibroblastların in vitro kültürü, cilt biyolojisi ve hastalığı anlayışımızda önemli gelişmelere yol açtı. Bu protokol, cilt fibroblastları eşzamanlı izolasyonu için izin verirken tutarlı melanosit kültürler oluşturmak için gerekli zaman ve teknik savvy azaltarak önceden melanosit yalıtım yöntemleri üzerine geliştirir. Bir roman, bu prosedürün zaman kazandıran unsuru dermis ve epidermis ayrı olması gerekmez olmasıdır. Bunun yerine, cilt hücreleri, seçici medya ve …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Damon Runyon Vakfı (Yenilik Ödülü #38-16-C.E.B.) ve Pelotonia (B.M.M.) mali destek için teşekkür ederiz. Biz C. Haines ve C. Wormsbaecher kim el yazması metin geliştirmek için yorum sağlanan minnettar. Bu iş Ohio Devlet kapsamlı Kanser Merkezi ‘nin analitik Cytometri paylaşılan kaynak NıH P30 CA016058 tarafından desteklenmektedir benefitted.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
Riferimenti
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A. Skin temperature: its role in thermoregulation. Acta Physiologica (Oxf). 210 (3), 498-507 (2014).
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35 (2), 193-199 (2009).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Melanocytes and their diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (5), (2014).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K. Oculocutaneous albinism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 2, 43 (2007).
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D’Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T. UV radiation and the skin. International Journal of Molecular Science. 14 (6), 12222-12248 (2013).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
