En protokoll presenteres ved hjelp av syntetiske biologi teknikker for å syntetisere et sett av bakteriell biosensors for analyse av skudd rester, og for å teste funksjon av enhetene for tiltenkt bruk ved hjelp av fluorescens spektroskopi.
MicRoboCop er en Biosensor som er designet for en unik anvendelse innen rettsmedisinske kjemi. MicRoboCop er et system bestående av tre enheter som, når de brukes sammen, kan indikere tilstedeværelsen av skudd rester (GSR) ved å produsere et fluorescens signal i nærvær av tre viktige analytter (antimon, bly, og organiske komponenter av GSR). Protokollen beskriver syntesen av biosensors ved hjelp av Escherichia coli (E. coli), og de analytiske kjemi metodene som brukes til å evaluere selektivitet og følsomheten til sensorene. Funksjonen til systemet er demonstrert ved hjelp av GSR innhentet fra innsiden av en brukt patron casing. En gang forberedt, det biosensors kan lagret til behøvde og kan brukes som test for disse nøkkel analytter. En positiv respons fra alle tre analytter gir en Presumptive positiv test for GSR, mens hver enkelt enhet har søknader om påvisning av analytter i andre prøver (f.eks. en detektor for bly forurensning i drikkevann). Den viktigste begrensningen av systemet er tiden det tar for et positivt signal; fremtidig arbeid kan innebære å studere forskjellige organismer for å optimalisere responstiden.
En Biosensor er enhver analytisk enhet som bruker biologiske komponenter (som proteiner, nukleinsyre syrer, eller hele organismer) som produserer et svar som kan brukes for påvisning av en kjemisk substans eller analytt. Som et eksempel, kullgruveindustrien brukt en Biosensor for mye av de 20th århundre for å oppdage tilstedeværelsen av giftige gruve gasser: kanarifuglen i kull gruven1. Den biologiske organisme (Canary ‘ s) respons (død eller nød) til en kjemisk analytt (karbonmonoksid) ble observert av gruvearbeiderne for å beskytte arbeiderne. I et mer moderne og sofistikert eksempel, kan bakterier endres ved hjelp av syntetiske biologi teknikker for å svare på tilstedeværelsen av en viss kjemisk analytt ved å stille et bestemt svar, for eksempeluttrykk for et fluorescerende protein.
Syntetisk biologi er et bredt begrep som refererer til bygging av biologiske enheter og systemer som ikke eksisterer naturlig, eller re-design av eksisterende biologiske systemer for et bestemt formål2. Syntetisk biologi skilles fra genetisk engineering av en standard metodikk og eksistensen av standardiserte deler (standard syntetisk biologi genetiske elementer) som kan brukes til å syntetisere enheter og systemer. En del er innført i Genova av en enhet, en organisme som en bakterie, for å uttrykke en viss egenskap som vil tjene som en indikasjon på funksjon. For eksempel, i mange syntetiske enheter, er uttrykket av et fluorescerende protein innført i en enkelt encellede organisme som reporter protein. Flere enheter kan kombineres til et system. Genomer av mikroorganismer som bakterier er lett å manipulere på denne måten. Mange eksempler på biosensors som er spesifikke for et bredt spekter av kjemiske analytter har blitt rapportert i litteraturen i løpet av det siste tiåret3,4.
I dette arbeidet, MicRoboCop systemet er presentert som et eksempel på en Biosensor utformet ved hjelp av syntetiske biologi teknikker med romanen programmer i rettsmedisinske og miljøkjemi. MicRoboCop er et system av tre separate enheter som, kombinert, vil tillate Escherichia coli å uttrykke rødt fluorescerende PROTEIN (RFP) i nærvær av skudd rester (GSR) som er samlet inn fra en persons hender eller en overflate. Hver av de tre enhetene reagerer på en bestemt kjemisk analytt som er kjent for å være en komponent i GSR5. De tre analytter som systemet svarer er jeg. 2, 4, 6-trinitrotoluene (TNT) og relaterte forbindelser, II. bly (i form av bly ioner), og III. antimon (også i form av ioner).
GSR består av mange forskjellige kjemiske stoffer, men de tre som vanligvis brukes til å identifisere en rest som GSR er barium, bly, og antimon5. Standard bevismessige test for identifisering av GSR er å bruke skanning elektron mikroskopi (SEM) med energi dispersive X-ray fluorescens (EDX)5. SEM-EDX lar analytikere å identifisere den unike morfologi og elementær komponenter av GSR. For tiden er det få mye brukt binære presumptive tester tilgjengelig. En nylig publisert presumptive test bruker ion-Mobility spektroskopi (IMS), som er spesialisert utstyr som kanskje ikke er tilgjengelig i mange laboratorier6. Det er også noen farge “spot” tester som kan brukes, selv om de vanligvis brukes for avstand besluttsomhet eller for GSR identifikasjon på bullet hull og sår5. I tillegg har det vært en viss begrenset oppmerksomhet i litteraturen til elektrokjemiske tester for GSR som benytter voltammetric analyse, som har fordelen av potensielt være feltet bærbare, eller anodisk stripping voltammetri, som er en ekstremt følsom metode for metalliske elementer7. Det er svært lite omtale i litteraturen i biosensors designet spesielt for det formål å oppdage GSR, men noen biosensors for andre rettsmedisinske søknader har blitt publisert8.
De biologiske elementene for hver enhet i MicRoboCop-systemet, og plasmider konstruksjonen, er illustrert i figur 1. Den buede pilen i figur 1B representerer arrangøren regionen som er aktivert i nærvær av analytt, er den ovale ribosomal bindende nettsted som tillater oversettelse av reporteren protein, den grå boksen er merket RFP er genet som uttrykker rød fluorescerende protein, og den røde Octagon er transkripsjon oppsigelse området. Alle tre enhetene vil bli brukt sammen som et system for å oppdage GSR. Hver enhet med en bestemt promoter (SbRFP, PbRFP og TNT-RFP) vil bli inkubert med prøven som blir testet og fluorescens av RFP vil bli målt. RFP vil bare bli uttrykt hvis den aktuelle kjemiske analytt er til stede og aktiverer promoter regionen. Tre enheter som responderer på noen av de kjemiske stoffene som finnes i GSR, er utformet og presenteres i dette arbeidet.
Den arrangører som brukes i de tre MicRoboCop enhetene er en arsen og antimon følsom promoter, SbRFP, en bly følsom promoter, PbRFP11,12 og en TNT følsom promoter, TNT-RFP 13. fordi et søk i litteraturen avslørte ingen promoter utformet for å svare på barium, ble TNT arrangøren valgt i stedet siden denne arrangøren er følsom for en rekke strukturelt relaterte forbindelser (særlig 2, 4-dinitrotoluene og dinitrobenzene) som er kjent for å være en del av de organiske forbindelsene etterlatt i GSR. Denne arrangøren har med hell blitt brukt til å spesifikt oppdage minutt mengder TNT og 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) i begravd land gruver13. Ved å bruke de tre enhetene sammen som et system, vil en positiv test for GSR produsere fluorescens i alle tre enhetene. En fluorescens signal i bare én eller to enheter vil indikere en annen miljømessig kilde til analytt (e) eller i tilfelle av TNT arrangøren, aktivering av en forbindelse som ikke er en organisk sammensatt etterlatt i GSR. Ved å bruke alle tre enhetene sammen, er muligheten for et falskt positivt resultat på grunn av miljømessige kilder minimert. Blyfri ammunisjon, som er stadig i popularitet, representerer fortsatt bare ca 5% av ammunisjon salg i USA; Derfor, falske negative resultater på grunn av fravær av bly kan være en mulighet, men det er fortsatt verktøyet i en sensor som bruker bly som en markør for GSR14. I tillegg til dette spesifikke rettsmedisinske programmet, kan hver enhet brukes separat for å oppdage miljøgifter.
Protokollene som presenteres inkluderer syntetiske biologi teknikker som brukes til å lage enheter (sensor bakterier) og analytiske teknikker for å sjekke funksjonen til enhetene og analysere fluorescens signalene innhentet. Protokollen inkluderer også innsamling av rettsmedisinske bevis i form av hånden tørke for å samle GSR fra hendene på en mistenkt eller skure å samle GSR fra en overflate. Resultater fra bly sensor enheten presenteres som eksempel resultater, sammen med en demonstrasjon av en positiv test for GSR ved hjelp av en brukt patron casing.
Modifikasjoner og feilsøking
Eksperimentet beskrevet i Tabell 4 kan endres på en hvilken som helst måte som passer til sensorene som er utformet. Det viktigste aspektet ved en kjemisk sensor er å evaluere sin følsomhet og spesifisitet. Det er fordelaktig å sikre at et bredt spekter av konsentrasjoner av analytt analyseres for å fastslå den nyttige analytiske rekkevidden til sensoren. Det er også verdt å bestemme et maksimalt nivå av analytt for cell…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne studentene ved Longwood University i BIOL 324 (genetikk) og studentene i CHEM 403 (Advanced kjemisk Laboratory problem løsning) som var involvert i den første forberedelse og testing av antimon og bly biosensors. Ideen til MicRoboCop ble unnfanget ved GCAT SynBIO workshop (sommer 2014), som er finansiert av NSF og Howard Hughes Medical Institute og drives av University of Maryland Baltimore County. Forfatterne erkjenner også finansiering mottatt fra Longwood University ‘ s Cook-Cole College of Arts and Sciences og GCAT SynBio Alumni Grant.
1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |