Ett protokoll presenteras med hjälp av syntetiska bio Logi tekniker för att syntetisera en uppsättning av bakteriella bio sensorer för analys av skott rester, och för att testa driften av enheterna för deras avsedda användning med fluorescensspektroskopi.
MicRoboCop är en bio sensor som har utformats för en unik tillämpning inom kriminal teknisk kemi. MicRoboCop är ett system som består av tre enheter som, när de används tillsammans, kan indikera förekomsten av skott rester (GSR) genom att producera en fluorescenssignal i närvaro av tre nyckelanalyter (antimon, bly och organiska komponenter av GSR). Protokollet beskriver syntesen av bio sensorerna med Escherichia coli (E. coli), och de analytiska kemi metoder som används för att utvärdera sensorernas selektivitet och känslighet. Systemets funktion demonstreras med hjälp av GSR som samlats in från insidan av ett använt patron hölje. När de har förberetts kan bio sensorerna lagras tills de behövs och kan användas som ett test för dessa nyckelanalyter. Ett positivt svar från alla tre Analyterna ger ett presumtivt positivt test för GSR, medan varje enskild enhet har tillämpningar för detektering av Analyterna i andra prover (t. ex. en detektor för bly förorening i dricks vatten). Den huvudsakliga begränsningen av systemet är den tid som krävs för en positiv signal; framtida arbete kan innebära att studera olika organismer för att optimera responstiden.
En bio sensor är en analytisk enhet som använder biologiska komponenter (t. ex. proteiner, nukleinsyror eller hela organismer) som ger ett svar som kan användas för detektion av ett kemiskt ämne eller en analyt. Som ett exempel, använde kol gruv industrin en bio sensor för mycket av 20-talet för att upptäcka förekomsten av giftiga gruv gaser: Kanarie fågeln i kol gruvan1. Den biologiska organismens (Kanarie öarnas) reaktion (död eller ångest) på en kemisk analyt (kolmonoxid) observerades av gruv arbetarna för att skydda arbetarna. I ett mer modernt och sofistikerat exempel kan bakterier ändras med hjälp av syntetiska bio Logi tekniker för att svara på närvaron av en viss kemisk analyt genom att ställa ut ett specifikt svar, såsom uttryck av ett fluorescerande protein.
Syntetisk biologi är ett brett begrepp som hänvisar till byggandet av biologiska anordningar och system som inte existerar naturligt, eller omkonstruktion av befintliga biologiska system för ett specifikt ändamål2. Syntetisk biologi skiljer sig från gen teknik genom en standard metodik och förekomsten av standardiserade delar (standard syntetiska biologi genetiska element) som kan användas för att syntetisera enheter och system. En del förs in i genomet av en anordning, en organism som en bakterie, att uttrycka en viss egenskap som kommer att fungera som en indikation på funktion. I många syntetiska produkter introduceras till exempel ett fluorescerande protein i en enda celledorganism som ett reporter protein. Flera enheter kan kombineras till ett system. Genom mikroorganismer som bakterier är lätta att manipulera på detta sätt. Många exempel på bio sensorer som är specifika för ett brett spektrum av kemiska analyter har rapporter ATS i litteraturen under det senaste decenniet3,4.
I detta arbete är MicRoboCop systemet presenteras som ett exempel på en bio sensor utformad med hjälp av syntetiska biologi tekniker med nya tillämpningar i kriminal teknisk och miljö kemi. MicRoboCop är ett system med tre separata enheter som, när de kombineras, kommer att göra det möjligt Escherichia coli att uttrycka rött fluorescerande protein (RFP) i närvaro av skott rester (GSR) som har samlats in från en persons händer eller en yta. Var och en av de tre enheterna reagerar på en specifik kemisk analyt som är känd för att vara en del av GSR5. De tre analyter som systemet svarar på är I. 2, 4, 6-trinitrotoluen (TNT) och besläktade föreningar, II. bly (i form av bly joner) och III. Antimon (även i form av joner).
GSR består av många olika kemiska ämnen, men de tre som vanligt vis används för att identifiera en rest som GSR är barium, bly, och antimon5. Det standardiserade bevis provet för identifiering av GSR är att använda scanning elektronmikroskopi (SEM) med energidispersiv röntgen fluorescens (EDX)5. SEM-EDX gör det möjligt för analytiker att identifiera den unika morfologin och elementär komponenterna i GSR. För närvarande finns det få utbredda binära presumtiva tester tillgängliga. En nyligen publicerad presumtiva test använder Jon-rörlighet spektroskopi (IMS), som är specialiserad utrustning som kanske inte finns i många Labs6. Det finns också några färg “spot”-tester som kan användas, även om de vanligt vis används för avstånds bestämning eller för GSR identifiering på kula hål och sår5. Dessutom har det förekommit viss begränsad uppmärksamhet i litteraturen till elektrokemiska tester för GSR som sysselsätter voltammetrisk analys, som har fördelen av att potentiellt vara fältet portabel, eller Anodisk strippning voltametri, vilket är en extremt känslig metod för metalliska element7. Det finns mycket lite omnämnande i litteraturen av bio sensorer som utformats speciellt för att upptäcka GSR, även om vissa bio sensorer för andra kriminal tekniska tillämpningar har publicerats8.
De biologiska elementen för varje enhet i MicRoboCop-systemet, och plasmidkonstruktionen, illustreras i figur 1. Den böjda pilen i figur 1b representerar den promotor region som aktive ras i närvaro av analyten, ovalen är den ribosomala bindnings platsen som tillåter översättning av reporterproteinet, den grå rutan märkt RFP är den gen som uttrycker röd fluorescerande protein, och den röda Oktagonen är transkriptionsterminerings platsen. Alla tre enheter kommer att användas tillsammans som ett system för att upptäcka GSR. Varje enhet med en specifik promotor (SbRFP, PbRFP och TNT-RFP) kommer att inkuberas med provet som testas och fluorescens av RFP kommer att mätas. RFP kommer endast att uttryckas om lämplig kemisk analyt finns och aktiverar Promotorns region. Tre enheter som reagerar på några av de kemiska ämnen som finns i GSR har utformats och presenteras i detta arbete.
De initiativtagare som används i de tre microbocop enheter är en arsenik och antimon känsliga Promotorn, sbrfp9,10, en ledande känslig promotor, pbrfp11,12 och en TNT känslig promotor, TNT-RFP 13. eftersom en sökning i litteraturen inte visade någon promotor som var avsedd att reagera på barium valdes TNT-Promotorn istället, eftersom denna promotor är känslig för ett antal strukturellt besläktade föreningar (i synnerhet 2, 4-dinitrotoluen och dinitrobensen) som är kända för att vara en del av de organiska föreningarna kvar i GSR. Denna promotor har framgångs rikt använts för att specifikt upptäcka minut mängder TNT och 2, 4-dinitrotoluen (2, 4-DNT) i begravda landminor13. Med hjälp av de tre enheterna tillsammans som ett system, ett positivt test för GSR kommer att producera fluorescens i alla tre enheter. En fluorescenssignal i endast en eller två enheter kommer att indikera en annan miljö källa av analyten (s) eller i fallet med TNT Promotorn, aktivering av en förening som inte är en organisk förening kvar i GSR. Genom att använda alla tre enheterna tillsammans minimeras möjligheten till ett falskt positivt resultat på grund av miljö källor. Blyfri ammunition, som ökar i popularitet, utgör fortfarande bara cirka 5% av ammunitions försäljningen i USA; Därför kan falskt negativa resultat på grund av avsaknad av bly vara en möjlighet, men det finns fortfarande nytta i en sensor som använder bly som en markör för GSR14. Utöver denna specifika kriminal tekniska applikation kan varje enhet användas separat för att upptäcka miljö föroreningar.
De protokoll som presenteras inkluderar syntetisk biologi tekniker som används för att skapa enheter (sensor bakterier) och analys metoder för att kontrol lera funktionen av enheterna och analysera fluorescens signaler som erhållits. Protokollet innehåller också insamling av kriminal tekniska bevis i form av hand torka för att samla GSR från händerna på en misstänkt eller badda att samla GSR från en yta. Resultat från bly sensor enheten presenteras som exempel resultat, tillsammans med en demonstration av ett positivt test för GSR med hjälp av ett använt patron hölje.
Ändringar och fel sökning
Experimentet som beskrivs i tabell 4 kan på något sätt anpassas till de sensorer som har konstruerats. Den viktigaste aspekten av en kemisk sensor är att utvärdera dess känslighet och specificitet. Det är fördelaktigt att se till att en mängd olika koncentrationer av analyten analyseras för att bestämma det användbara analytiska omfånget av sensorn. Det är också värt att fastställa en maximal nivå av analyt för ce…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna studenterna vid Longwood University i BIOL 324 (genetik) och studenterna i CHEM 403 (Advanced Chemical Laboratory problemlösning) som var inblandade i den inledande beredning och testning av antimon och bly bio sensorer. Idén till MicRoboCop var tänkt på GCAT SynBIO workshop (sommar 2014), som finansieras av NSF och Howard Hughes Medical Institute och värd University of Maryland Baltimore County. Författarna erkänner också finansiering som erhållits från Longwood University ‘ s Cook-Cole College of Arts and Sciences och GCAT SynBio Alumni Grant.
1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |