Bir do-it-yourself Bioprinter ile tasarlanan Biyosilmların üç boyutlu deseni
Summary
Bu makalede, düşük maliyetli bir ticari 3D yazıcıyı, desenli biyosilmların yazdırmayı kolaylaştıracak bir bakteriyel 3D yazıcıya dönüştürme yöntemi açıklanır. Bioprinter ve biyo-mürekkep hazırlama tüm gerekli yönleri, hem de biyolojiler oluşumunu değerlendirmek için doğrulama yöntemleri açıklanmıştır.
Abstract
Biyosilmler, kendi kendine üretilen bir uzamsal desenli ekstrellüler matriks içinde gömülü bakteri toplamları vardır. Bir biyofilm içindeki bakteriler, potansiyel sağlık tehlikeleri gösteren gelişmiş antibiyotik direnci geliştirir, ama aynı zamanda içme suyu arıtma gibi çevresel uygulamalar için yararlı olabilir. Anti-bakteriyel terapötik ve biyofilm esinlenerek uygulamaların daha da geliştirilmesi, biyofilm oluşturma için yeniden üretilebilen, mühendislere yönelik yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyacaktır. Son zamanlarda, bir bakteriyel mürekkep ile değiştirilmiş bir üç boyutlu (3D) yazıcı kullanarak biyofilm hazırlama yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu makalede, bakteriye bağlı malzeme işleme birden fazla uygulama sunan bu verimli, düşük maliyetli 3D bioprinter oluşturmak için gerekli adımları açıklar. Protokol, Ekstruder ‘in, kontrol edilebilir ve sürekli biyo-mürekkep akışını sağlayan bir şırınga pompası sistemine bağlı bir biyo-mürekkep dispenseri ile değiştirildiği uyarlanmış bir ticari 3D yazıcıyla başlar. Biyofilm baskı için uygun bir biyo-mürekkep geliştirmek için, tasarlanan Escherichia coli bakteri alginat bir çözelti içinde askıya alındı, böylece kalsiyum içeren bir yüzey ile temas içinde katılaşma. Baskı substrat içinde bir indükleştirici kimyasal dahil edilen biyo-mürekkep içinde biyofilm proteinleri ifade sürücüler. Bu yöntem, yazdırılan biyosillerin ayrık katmanlarından oluşan çeşitli uzamsal desenler 3D baskı sağlar. Bu tür uzamsal kontrollü biyosiller model sistemleri olarak hizmet verebilir ve diğerleri arasında, antibiyotik direnci önleme veya içme suyu arıtma dahil olmak üzere toplum üzerinde geniş kapsamlı bir etkiye sahip birden fazla alanda uygulamaları bulabilirsiniz.
Introduction
Şu anda, bu tür malzemeler için pazarlar genişleyen sayısı nedeniyle, dağınık desenli malzemelerin üretimi için çevre dostu, sürdürülebilir çözümler geliştirmek için artan bir ihtiyaç vardır1. Bu makalede, bu tür malzemelerin üretimi için basit, ekonomik bir yöntem sunuyor ve bu nedenle gelecekteki uygulamaların büyük bir spektrum sunuyor. Burada sunulan yöntem üç boyutlu (3D) bir biyo-mürekkep yaşayan bakteri içeren kullanarak dağınık desenli yapıların baskı sağlar. Bakteriler, bir haftadan fazla bir süre için baskılı yapıların içinde uygun kalır, bakteri doğal veya mühendislik metabolik faaliyetleri gerçekleştirmek için olanaklı kılmak. Baskılı bakteri böylece üretmek ve basılı yapısı içinde istenilen bileşenleri yatırmak, örneğin işlevsel bir çapraz bağlantılı biyofilm oluşturma2.
Gelişmiş malzemelerin üretimi için geleneksel yöntemler yüksek enerji harcamalarını (örn. yüksek sıcaklıklar ve/veya baskılar) içerir ve büyük miktarlarda kimyasal atık üretebilir, genellikle maliyet kapsamlı kullanım gerektiren toksik maddeler3 ,4. Buna karşılık, birden fazla bakteriyel türler kolayca çeşitli sektörlerde uygulanabilir malzemeler üretebilir. Bu malzemeler arasında polyhydroxyalkanoates (PHA)5 veya Poly (glycolide-Co-lactide) (PGLA)6, bakteriyel selüloz7, bakteriyel beton malzemeleri8, biyomimetik kompozitler9, amiloid bazlı yapıştırıcılar10veya Bio tabanlı elektrik şalterleri11, diğerleri arasında. Dahası, değerli malzemelerin bakteriyel üretimi genellikle yakın ortam sıcaklıklarında ve basınçlarda ve sulu ortamlarda, toksik bileşikler gerektirmeden veya üreterek gerçekleşir. Literatürde bakterilere sahip malzemeler üretilirken, bazı endüstriyel uygulamalar zaten12,13, bu tür malzemelerin uzamsal deseni için güvenilir bir yöntem ortaya çıkmıştır.
Bu makalede, düşük maliyetli bir ticari 3B yazıcıyı 3B bakteriyel yazıcıya dönüştürmenin düz ileriye dönük bir yöntemi gösterilmektedir. Protokol, yaşam bakterilerini içeren ve sürdürmeye yarayan bir biyo-mürekkebin nasıl hazırlanacağı, hem de 3D baskının gerçekleştirilebilecek alt yüzeylerini nasıl hazırlamaktır. Bu yöntem, malzeme üretebilen çeşitli doğal ve mühendislik bakteriyel suşları ile kullanmak için uygundur. Bu bakteriler, bir 3D baskılı yapı içinde dağınık bir şekilde dağıtılır ve hala bakteri tarafından üretilen istenilen malzemelerin bir uzamsal dağılımı neden olacak metabolik aktivite, devam edebilir.
Bu baskı yöntemi biyosilme katkı üretimi sağlar, kendi kendine üretilen bir ekstrellüler matris ile çevrili bakteri toplamları. Biofilms hangi proteinler, polimerler, bakteriyel hücreler, oksijen ve besin tüm uzamsal yapılandırılmış olan heterojen 3D ağlar14. Bir biyofilm şeklinde iken, bakterilerin artan bir antibiyotik direnci ve yapısal sağlamlık sergiler, onları zor tıbbi kateter ve implantlar dahil yüzeylerden ortadan kaldırmak için yapmak. Biyofilm özellikleri için anahtar ve aynı zamanda en büyük zorluk biyofilm araştırma, biyofilm heterojenliği gibi görünüyor15,16,17. Dağınık kontrollü model biyofilmlerinin üretimi, biyofilm bileşenlerinin uzamsal desenlerini yeniden üretmeye veya ayarlamaya izin verecek şekilde özel bir ilgidir, neredeyse her yüzeyde biofillerin istikrarlı bir şekilde birikmesini anlamakta Doğa.
Bu makalede, bir indükör varlığında biyofilm proteinleri üreten mühendislik E. coli bakterileri içeren 3D baskılı Hidrojeller kullanarak biyofilm üretimi için bir yöntem sunar, hem de biyolojik madde oluşumu doğrulama yöntemleri2 . Bu biyosillerin ana ekstrelüler matris bileşenleri, kendinden birleştirilmiş csga proteinlerini içeren18 ‘ lik kaydırma amiloid lifleridir. E. coli bakterileri csga proteinlerini ifade etmeye indüklenmiş olduğunda, hücreleri baskı yüzeyinin yıkanması karşı koruyan istikrarlı bir model biyofilm oluşturur. Böyle bir 3D baskılı biyofilm, uzamsal olarak kontrol edilebilir ve çok ölçekli biyofilm yapısı-fonksiyon mekaniği veya materomics19soruşturma için yararlı bir araştırma aracı olarak hizmet verebilir. Bu ısmarlama biyofilm diğer uygulamalar arasında antibiyotik direnci mekanizmaları içine daha fazla araştırma sağlayan, biyofilm oluşumu ve mekanik özellikleri ilkelerini anlayış yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mühendislik biyosilmlarının 3D baskı için burada sunulan protokol iki kritik adımlara sahiptir. Öncelikle, özel bir baskı çözünürlüğü üreten en kritik faktör olan agar baskı yüzeyinin hazırlanması. Baskı yüzeyinin düz olduğundan ve yazıcı kafasının üzerindeki pipet ucunun yüzeyden doğru yükseklikte konumlandırıldığından emin olmak önemlidir. Yüzey düz değilse, çalışma mesafesi yazdırma işlemi sırasında değişecek. Çalışma mesafesi 0,1 mm ‘den az ise, CaCl2 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma bir AOARD Grant tarafından destekleniyordu (No. FA2386-18-1-4059), Hollanda bilimsel araştırma organizasyonu (NWO/OCW) nanoscience programının Frontiers ve gelişmiş malzemeler NWO-NSFC programı (No. 729.001.016) bir parçası olarak. Yazarlar, Ramon Van der Valk ve Roland Kieffer ‘in laboratuar yardımını kabul ediyor.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
Riferimenti
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
